Electrophysiological अध्ययन के लिए वयस्क माउस रेटिना की क्षैतिज स्लाइस की तैयारी
Summary
हम रेटिना की सतह के समानांतर सेक्शनिंग के विमान के साथ वयस्क स्तनधारी रेटिना के एक क्षैतिज टुकड़ा तैयारी विकसित की है। nonradially उन्मुख रेटिना न्यूरॉन्स के वृक्ष के समान क्षेत्रों छोटा नहीं कर रहे थे, पैच दबाना और इमेजिंग तकनीक के साथ सिग्नल प्रोसेसिंग के अध्ययन की अनुमति।
Abstract
कार्यक्षेत्र टुकड़ा तैयारी अच्छी तरह से वयस्क स्तनधारी रेटिना में circuitry और संकेत संचरण अध्ययन करने के लिए स्थापित कर रहे हैं। इन तैयारियों में सेक्शनिंग के विमान रेटिना की सतह को सीधा है, यह फोटोरिसेप्टर और द्विध्रुवी कोशिकाओं की तरह त्रिज्यात उन्मुख न्यूरॉन्स के अध्ययन के लिए आदर्श बना रही है। हालांकि, क्षैतिज कोशिकाओं, व्यापक क्षेत्र amacrine कोशिकाओं, और नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं के बड़े वृक्ष के समान arbors ज्यादातर छोटा हैं, इन कोशिकाओं में स्पष्ट रूप से कम synaptic गतिविधि को छोड़कर। नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं और विस्थापित amacrine कोशिकाओं रेटिना की एक पूरी मुहिम शुरू की तैयारी में अध्ययन किया जा सकता है, जबकि, क्षैतिज कोशिकाओं और amacrine भीतर परमाणु परत में स्थित कोशिकाओं केवल खराब पूरे रेटिना के ऊतकों में इलेक्ट्रोड के लिए पहुंच रहे हैं।
अधिकतम पहुंच और synaptic अखंडता को प्राप्त करने के लिए, हम माउस रेटिना के एक क्षैतिज टुकड़ा तैयारी विकसित की है, और फोटोरिसेप्टर और क्षैतिज के बीच अन्तर्ग्रथन में संकेत संचरण का अध्ययनकोशिकाओं। क्षैतिज सेक्शनिंग क्षैतिज सेल डेन्ड्राइट को बरकरार है और कार्यात्मक कोन synaptic इनपुट के लिए एक शर्त के रूप में, (1) आसान और स्पष्ट इलेक्ट्रोड लक्ष्य-निर्धारण के लिए क्षैतिज सेल शरीर के दृश्य पहचान, और (2) विस्तारित क्षैतिज सेल वृक्ष के समान क्षेत्रों के संरक्षण के लिए अनुमति देता है।
क्षैतिज स्लाइस से क्षैतिज कोशिकाओं अंधेरे में टॉनिक synaptic गतिविधि का प्रदर्शन किया है, और वे आवक वर्तमान और कम synaptic गतिविधि की कमी के साथ प्रकाश की चमक जानकारी देने के लिए प्रतिक्रिया व्यक्त की। Immunocytochemical सबूत इंगित करता है कि एक क्षैतिज सेल के वृक्ष के समान क्षेत्र के भीतर लगभग सभी शंकु अपने परिधीय डेन्ड्राइट के साथ synapses की स्थापना। क्षैतिज टुकड़ा तैयारी इसलिए अच्छी तरह से चयनित synapses पार क्षैतिज बढ़ाया रेटिना न्यूरॉन्स के शारीरिक गुणों के साथ ही संवेदी संकेत संचरण और एकीकरण का अध्ययन करने के लिए अनुकूल है।
Introduction
विजुअल जानकारी फोटोरिसेप्टर सक्रियण के एक गतिशील स्थानिक-सामयिक पैटर्न के रूप में कोडित है, और फोटोरिसेप्टर और दूसरे क्रम न्यूरॉन्स के बीच रिबन अन्तर्ग्रथन दृश्य सूचना के बहाव के हस्तांतरण निर्धारित करता है। स्तनधारी रेटिना के ऊर्ध्वाधर टुकड़ा तैयारी, खड़ी रास्ते में सिग्नल प्रोसेसिंग अध्ययन करने के लिए यानी फोटोरिसेप्टर और द्विध्रुवी कोशिकाओं के बीच, और द्विध्रुवी कोशिकाओं और amacrine सेल 1, 2, 3, 4 के कुछ प्रकार के बीच एक बेहद महत्वपूर्ण उपकरण है।
हालांकि, खड़ी सेक्शनिंग हमेशा की तरह, कई रेटिना न्यूरॉन्स के वृक्ष के समान क्षेत्रों के गंभीर ट्रंकेशन का कारण बनता है synaptic संपर्कों का काफी नुकसान के लिए अग्रणी। विशेष रूप से बाहरी रेटिना में क्षैतिज कोशिकाओं उनके laterally फैल बढ़ाया वृक्ष के समान क्षेत्रों और अक्षतंतु टर्मिनल सिस्टम 5 की वजह से प्रभावित कर रहे हैं। एक ऊर्ध्वाधर मेंटुकड़ा तैयारी, एक क्षैतिज सेल के डेन्ड्राइट के लिए कोन फोटोरिसेप्टर टर्मिनलों के सैकड़ों synaptic इनपुट इस प्रकार कुछ विरल संपर्क करने के लिए कम है। यह synapses व्यक्ति के गुणों का अध्ययन करने के लिए पर्याप्त हो सकता है, लेकिन किसी भी तरह से सिग्नल प्रोसेसिंग फोटोरिसेप्टर रिबन synapses के सिंक्रनाइज़ सक्रियण अंतर्निहित क्षमताओं का प्रतिनिधित्व करता है।
इसलिए हम एक क्षैतिज टुकड़ा तैयारी है, जो बरकरार है और कार्यात्मक क्षैतिज सेल डेन्ड्राइट के लिए लगभग सभी कोन फोटोरिसेप्टर की synaptic इनपुट के पत्तों का विकास किया। सेक्शनिंग रन के विमान रेटिना की सतह के समानांतर, आदर्श क्षैतिज कोशिकाओं और amacrine कोशिकाओं के बीच भीतर परमाणु परत के माध्यम से काटने। इस प्रकार, बाहरी रेटिना की क्षैतिज स्लाइस युक्त बनाई गई हैं, प्रेस्य्नाप्तिक साइट पर, भीतरी और बाहरी क्षेत्रों के साथ-साथ synaptic टर्मिनलों, और क्षैतिज कोशिकाओं और द्विध्रुवी कोशिकाओं पोस्टअन्तर्ग्रथनी साइट पर साथ फोटोरिसेप्टर। यह तैयारी अच्छी तरह से टी अनुकूल हैओ इसकी वृक्ष के समान क्षेत्र के भीतर सभी कोन फोटोरिसेप्टर से क्षैतिज सेल dendrites में समन्वित अन्तर्ग्रथनी आदानों की जाँच। यह इस तरह बेहतर फोटोरिसेप्टर रिबन अन्तर्ग्रथन, जो फोटोरिसेप्टर सक्रियण के मैट्रिक्स से दृश्य सूचना के हस्तांतरण के एक पोस्टअन्तर्ग्रथनी प्रतिक्रिया में के लिए महत्वपूर्ण है के कामकाज को समझने के लिए उपयोगी साबित हो सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
ऊर्ध्वाधर स्लाइस के विपरीत, क्षैतिज कोशिकाओं और amacrine कोशिकाओं की तरह त्रिज्यात उन्मुख न्यूरॉन्स के वृक्ष के समान आकृति विज्ञान अच्छी तरह से संरक्षित है। पूरे रेटिना की तैयारी की तुलना में, इन प्रकार क?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG FOR701 and FE464/11-1 to A.F. The authors want to acknowledge the excellent technical assistance of Andrea Nerz.
Materials
| Ames' Medium | Sigma | A1420 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| Hepes | Sigma | H3375 | |
| Carbogen | Air Liquide | ||
| Agarose | Sigma | A9045 | |
| 35-mm petri dish (plastic) | Nunc Thermofisher | 150318 | |
| Glass petri dish | Chemoline | 50-1470-40 | |
| Isoflurane | Dispensary university hospital | ||
| Vibratome injector blade | Biosystems | 39053250 | |
| Vibratome | Leica Microsystems | VT1200 | |
| Vibrocheck | Leica Microsystems | ||
| Microwave | |||
| Water bath | |||
| Forceps | |||
| 20-gauge needles | |||
| Spring scissors | |||
| Curved scalpel blades | |||
| Stereo microscope | |||
| Plastic Pasteur pipette | |||
| Glass Pasteur pipette |
References
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