Udarbejdelse af horisontale Skiver af Voksen Mouse Retina for Elektrofysiologiske Studies
Summary
Vi udviklede en horisontal skive forberedelse af et voksent pattedyr nethinden med planet for sektionering parallelt retinaoverfladen. Dendritiske områder nonradially orienterede retinale neuroner blev ikke afkortet, så studiet af signalbehandling med patch-clamp og billedbehandling teknikker.
Abstract
Lodrette slice præparater er veletablerede til at studere kredsløb og signal transmission i et voksent pattedyr nethinden. Planet af sektionering i disse præparater er vinkelret på den retinale overflade, hvilket gør den ideel til studiet af radialt orienterede neuroner som fotoreceptorer og bipolære celler. Men den store dendritiske dorne af vandrette celler, wide-field amacrine celler og ganglieceller er for det meste trunkeret, efterlader markant reduceret synaptisk aktivitet i disse celler. Henviser ganglieceller og fordrevne amacrine celler kan undersøges i en hel-monteret fremstilling af nethinden, horisontale celler og amacrine celler placeret i den indre nukleare lag kun er dårligt tilgængelige for elektroder i hele retina væv.
For at opnå maksimal tilgængelighed og synaptisk integritet, vi udviklet en horisontal skive forberedelse af musen nethinden, og studerede signal transmission ved synapsen mellem fotoreceptorer og horisontalceller. Vandret sektionering tillader (1) let og entydig visuel identifikation af horisontale celle organer for elektrode målretning, og (2) bevarelse af de udvidede horisontale celle dendritiske felter, som en forudsætning for intakt og funktionel kegle synaptiske input til vandrette celle dendritter.
Vandrette celler fra horisontale skiver udstillet tonic synaptisk aktivitet i mørket, og de svarede at orientere lysglimt med en reduktion af indadgående strøm og formindsket synaptisk aktivitet. Immuncytokemisk evidens for, at næsten alle kegler inden den dendritiske område en horisontal celle etablere synapser med sine perifere dendritter. Den horisontale forberedelse skive er derfor velegnet til at studere de fysiologiske egenskaber af horisontalt udvidede retinale neuroner samt sensorisk signaltransmission og integration på tværs af udvalgte synapser.
Introduction
Visuel information er kodet som en dynamisk spatio-temporale mønster af fotoreceptor-aktivering, og båndet synapse mellem fotoreceptorer og anden ordens neuroner bestemmer nedstrøms overførsel af visuel information. Den lodrette skive forberedelse af den mammale nethinden er et meget værdifuldt værktøj til at studere signalbehandling i lodrette veje, dvs. mellem fotoreceptorer og bipolære celler, og mellem bipolære celler og nogle typer af amacrine celle 1, 2, 3, 4.
Imidlertid vertikal skæring forårsager altid alvorlig trunkering af de dendritiske områderne mange retinale neuroner, hvilket fører til betydelige tab af synaptiske kontakter. Især i den ydre nethinde, er vandrette celler påvirkes på grund af deres sideværts spredt udvidede dendritiske marker og Axon terminalsystemer 5. I en lodretskive forberedelse, den synaptiske input af hundredvis af kegle fotoreceptor terminaler til dendritter af horisontal celle reduceres således til et par sparsomme kontakter. Dette kan være tilstrækkeligt at studere egenskaberne af de enkelte synapser, men det betyder på ingen måde repræsenterer signal databehandling ligger til grund for synkroniseret aktivering af fotoreceptor bånd synapser.
Vi udviklede derfor en horisontal skive præparat, der efterlader næsten hele keglen fotoreceptor synaptiske input til horisontale celle dendritter intakt og funktionel. Planet af sektionering løber parallelt med overfladen af nethinden, ideelt skærer gennem det indre nukleare lag mellem horisontale celler og amacrine celler. Således er vandrette skiver af den ydre nethinde skabt et indhold på præsynaptiske sted, fotoreceptorer med indre og ydre segmenter samt synaptiske terminaler og horisontale celler og bipolære celler på den postsynaptiske site. Dette præparat er velegnet to undersøge koordinerede synaptiske input i vandrette celle dendritter af alle kegle fotoreceptorer inden for sit dendritiske felt. Det således kan vise sig nyttigt at bedre at forstå funktionen af fotoreceptor bånd synapse, som er afgørende for overførsel af visuel information fra matrix af fotoreceptor aktivering i en postsynaptiske respons.
Protocol
Representative Results
Discussion
I modsætning til lodrette skiver, er den dendritiske morfologi radialt orienterede neuroner som horisontale celler og amacrine celler velbevaret. Sammenlignet med hele nethinden præparater, disse celletyper er let tilgængelige for mikroelektroder og kan studeres af både elektrofysiologiske og billeddannende teknikker. Her har vi fokuseret på den ydre nethinde; imidlertid blevet rapporteret en lignende fremgangsmåde især for amacrine celler i den indre nethinde 10.
<p class="jove_conten…Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG FOR701 and FE464/11-1 to A.F. The authors want to acknowledge the excellent technical assistance of Andrea Nerz.
Materials
| Ames' Medium | Sigma | A1420 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| Hepes | Sigma | H3375 | |
| Carbogen | Air Liquide | ||
| Agarose | Sigma | A9045 | |
| 35-mm petri dish (plastic) | Nunc Thermofisher | 150318 | |
| Glass petri dish | Chemoline | 50-1470-40 | |
| Isoflurane | Dispensary university hospital | ||
| Vibratome injector blade | Biosystems | 39053250 | |
| Vibratome | Leica Microsystems | VT1200 | |
| Vibrocheck | Leica Microsystems | ||
| Microwave | |||
| Water bath | |||
| Forceps | |||
| 20-gauge needles | |||
| Spring scissors | |||
| Curved scalpel blades | |||
| Stereo microscope | |||
| Plastic Pasteur pipette | |||
| Glass Pasteur pipette |
References
- DeVries, S. H., Li, W., Saszik, S. Parallel processing in two transmitter microenvironments at the cone photoreceptor synapse. Neuron. 50, 735-748 (2006).
- Jackman, S. L., et al. Role of the synaptic ribbon in transmitting the cone light response. Nature Neuroscience. 12 (3), 303-310 (2009).
- Rabl, K., Cadetti, L., Thoreson, W. B. Kinetics of exocytosis is faster in cones than in rods. J. Neurosci. 25 (18), 4633-4640 (2005).
- Singer, J. H., Lassová, L., Vardi, N., Diamond, J. S. Coordinated multivesicular release at a mammalian ribbon synapse. Nature Neuroscience. 7 (8), 826-833 (2004).
- Peichl, L., González-Soriano, J. Morphological types of horizontal cell in rodent retinae: a comparison of rat, mouse, gerbil, and guinea pig. Vis. Neurosci. 11, 501-517 (1994).
- Ames, A., Nesbett, F. B. In vitro retina as an experimental model of the central nervous system. J. Neurochem. 37 (4), 867-877 (1981).
- Mathis, D. M., Furman, J. J., Norris, C. M. Preparation of acute hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations during aging and amyloid pathology. J. Vis. Exp. (49), (2011).
- Peichl, L., Sandmann, D., Boycott, B. B. Comparative anatomy and function of mammalian horizontal cells. Development of the Retina. , (1998).
- Feigenspan, A., Babai, N. Functional properties of spontaneous excitatory currents and encoding of light/dark transitions in horizontal cells of the mouse retina. Eur. J. Neurosci. 42 (9), 2615-2632 (2015).
- Enoki, R., Jakobs, T. C., Koizumi, A. Horizontal slice preparation of the retina. J. Vis. Exp. (1), e108 (2006).
- Babai, N., et al. Functional roles of complexin3 and complexin4 at mouse photoreceptor ribbon synapses. J. Neurosci. 36, 6651-6667 (2016).
- Thoreson, W. B. Horizontal slices of mouse retina expose horizontal cells and their properties (Commentary on Feigenspan & Babai). Eur. J. Neurosci. 42 (9), 2613-2614 (2015).
