Système d'expression multigène médié par l'ARN T7 à ADN polymère induible, pMGX

Summary

Cette étude décrit des méthodes pour la co-expression médiée par T7 de plusieurs gènes à partir d'un seul plasmide dans Escherichia coli en utilisant le système de plasmide pMGX.

Abstract

La co-expression de protéines multiples est de plus en plus essentielle pour la biologie synthétique, l'étude des complexes protéines-protéines, et la caractérisation et l'atténuation des voies de biosynthèse. Dans ce manuscrit, on décrit l'utilisation d'un système hautement efficace pour la construction d'opérons synthétiques multigènes sous le contrôle d'une ARN polymérase T7 inducible. Ce système permet d'exprimer plusieurs gènes simultanément à partir d'un plasmide. Ici, un ensemble de quatre vecteurs apparentés, pMGX-A, pMGX-hisA, pMGX-K et pMGX-hisK, avec le marqueur sélectionnable par résistance à l'ampicilline ou à la kanamycine (A et K) et possédant ou n'ayant pas d'hexahistidine N-terminale Tag (son) est divulgué. Des protocoles détaillés pour la construction d'opérons synthétiques utilisant ce système vectoriel sont fournis avec les données correspondantes, montrant qu'un système à base de pMGX contenant cinq gènes peut être facilement construit et utilisé pour produire les cinq protéines codées dans Escherichia coli . Ce systèmeEm et le protocole permet aux chercheurs d'exprimer systématiquement des modules et des chemins multi-composants complexes dans E. coli .

Introduction

La co-expression de multiples protéines est de plus en plus essentielle, en particulier dans les applications de biologie synthétique, où plusieurs modules fonctionnels doivent être exprimés ¹ ; Dans l'étude des complexes protéine-protéine, où l'expression et la fonction nécessitent souvent une co-expression ^{2 , 3} ; Et dans la caractérisation et l'exploitation des voies de biosynthèse, où chaque gène dans la voie doit être exprimé ^{4 , 5 , 6 , 7 ,} <....

Protocol

1. Obtention de gènes d'intérêt

1. Concevoir des gènes synthétiques.
   1. Optimiser une séquence de gènes pour l'expression de E. coli .
   2. Supprimez tous les sites de restriction problématiques de la séquence (AvrII, NdeI, EcoRI et XbaI).
   3. Incorporer des sites de restriction pour le clonage; Un site 5'-NdeI et un site 3'-EcoRI sont recommandés. D'autres sites peuvent être utilisés, si nécessaire; Se référer à la région de multiclonation du plasmide sélectionné ( Figure S1 -S4 ). Si vous le souhaitez, incluez une étiquette de codage 5 'ou 3'....

Results

Dans cette étude, l'objectif était de coexprimer cinq protéines à partir d'un seul plasmide. Les fragments de gènes synthétiques optimisés à cinq codons codant pour les marqueurs hexahistidine N- ou C-terminaux ont été achetés dans le commerce. Les gènes synthétiques ont été amplifiés par PCR et clonés individuellement dans un vecteur brut de PCR et séquencés. Pour générer le plasmide polycistronique, les cinq gènes d'intérêt ont d'abord été clonés dans un plasmide pMGX approprié, pMGX-A.......

Discussion

La co-expression de multiples gènes est de plus en plus essentielle, en particulier dans la caractérisation et la reconstitution des voies métaboliques multigène complexes ^{3 , 4 , 5} . Le système pMGX fait une co-expression multigène dans la routine E. coli ^{6 , 7 , 8} et accessible à divers chercheurs. Dans cette étude, on a mon.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
enzymes
Phosphatase alcaline, intestinale de veau (CIP)	New England Biolabs	M0290S
AvrII	New England Biolabs	R0174S
EcoRI	New England Biolabs	R0101S
NdeI	New England Biolabs	R0111S
XbaI	Nouveau Angleterre Biolabs	R0145S
Herculase II Fusion ADN polymérase	Agilent Technologies	600677
T4 ADN Ligase	New England Biolabs	M0202S
Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Comments
>Reagents
1 kb Échelle d’ADN	New England Biolabs	N3232L
4-20 % Mini-PROTEAN TGX Gels protéiques sans coloration	Bio-Rad	456-8095
50x TAE	Fisher Thermo Scientific	BP1332-4
Agar	Fisher Thermo Scientific	BP1423-500
Agarose	Fisher Thermo Scientific	BP160-500
Ampiciline	Sigma-Alrich	A9518-5G
BL21 (DE3) Cellules			comeptentes Cellule comeptente préparée en maison
B-PER Réactif d’extraction de protéines bactériennes	Fisher Thermo Scientific	PI78243
dNTP mix	Agilent Technologies
	d’extraction de gel de polyméraseOmega	D2500-02	E.Z.N.A Gel Extraction, fourni par VWR Cat 3 : CA101318-972
Glycine	Fisher Thermo Scientific	BP381-1
His Tag Anticorps [HRP], mAb, souris	GenScript	A00612
Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrat	EMD Millipore	WBKLS0100
IPTG	Sigma-Alrich	15502-10G
LB	Fisher Thermo Scientific	BP1426-500
Méthanol	Fisher Thermo Scientific	A411-20
Lait écrémé instantané pasteurisé en poudre	Épicerie		lait d’épicerie sans nom est adéquat
Membrane de nitrocellulose	Amersham Protran (GE Healthcare Life Sciences)	10600007	Membrane PT 0.45 µ ; m 200 mm x 4 m, fourni par VWR Cat # : CA10061-086
Kit d’isolement de l’ADN plasmidique	Omega	D6943-02	E.Z.N.A MiniKit d’ADN plasmidique I, fourni par VWR Cat # : CA101318-898
pMGX	Boddy Lab		Demande du laboratoire Boddy Contact cboddy@uottawa.ca
Amorces	d’ADN		Concevez les amorces selon les besoins pour le gène souhaité
Synthetic Gene Life	Technologies		Concevoir et optimiser selon les besoins
Papier Filtre Transfert Épais	Bio-Rad	1703932
Base Tris	BioShop	TRS001.1
Tween-20	Sigma-Alrich	P9416-50ML
XL1-Blue Cellules			Cellule comeptente préparée en interne
Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Comments
Equipment
BioSpectrometer	Eppendorf	RK-83600-07
Boîte de gel - PAGE	Bio-Rad	1658005	Mini-PROTEIN Tetra Vertical Electrophoresis Cell
Gel Imager	Alpha Innotech		AlphaImager EC
Incubateur-four	Fisher Thermo Scientific	11-690-650D
Isotemp Incubateur-agitateur	Fisher Thermo Scientific	SHKE6000-7	MaxQ 6000
Rasoirs Personna	Fisher Thermo Scientific	S04615
Bloc d’alimentation	Bio-Rad	S65533Q	FB300
Transilluminateur	VWR International	M-10E,6W
Thermocylcer	Eppendorf	Z316091	Mastercycler Personal, fourni par Sigma
UV Face-Shield		18-999-4542
Waterbath	Fisher Thermo Scientific	15-460-2SQ
Western Transfer Apparatus	Bio-Rad	1703935	Mini-Trans Blot Cell