Une cellule de Blood Red Simple Lysis Méthode pour la création de B lymphoblastoïdes lignées cellulaires

Summary

Une méthode de lyse simple, des globules rouges du sang pour établir B-LCLs a été développé avec une grande efficacité de l'immortalisation, ce qui nécessite une petite quantité de sang et un gain de temps de l'initiation à la cryoconservation.

Abstract

Il existe un certain nombre de méthodes pour la transformation des lymphocytes B par le virus d’Epstein Barr in vitro en lignées cellulaires immortalisées. Nous avons développé une nouvelle méthode avec une stratégie puissante et simple pour la mise en place des B-LCLs, la méthode de lyse des globules rouges. Cette méthode a simplifié la procédure de séparation PBMC avec l’élimination des globules rouges, et a utilisé aussi peu que 0,5 ml de sang total pour établir des lignées cellulaires immortalisées par l’EBV, qui peuvent proliférer jusqu’à un grand nombre de cellules dans un laps de temps relativement court avec un taux de réussite de 100 %. La méthode est simple, fiable, permet de gagner du temps et est applicable au traitement d’un grand nombre d’échantillons cliniques.

Introduction

Les lymphocytes B au repos pourraient être transformés in vitro par le virus d’Epstein-Barr (EBV) en lignées de lymphoblastoïdes B (LCL-B) à prolifération active. Les B-LCL sont similaires aux cellules germinales en termes de différenciation et de développement, et le taux de mutation somatique des B-LCL n’était que de 0,3 %¹, avec une altération génétique et phénotypique négligeable. Par conséquent, les B-LCL, en tant que substituts des cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC), ont considérablement accéléré les progrès de l’étude génomique, transcriptomique et protéomique des maladies associées à l’EBV^2,3. De plus, les B-LCL on....

Protocol

Cette étude a été approuvée par le Comité d'éthique de l'Institut de génétique et de biologie du développement, et le protocole suit les directives institutionnelles pour le bien-être humain.

1. Préparation de EB Virus

1. Le jour 1, décongeler les cellules B95-8 et la culture dans 6 ml de milieu RPMI 1640 complet additionné de 10% de sérum bovin fœtal, 2 mM de L-glutamine et des antibiotiques (100 pg / ml de streptomycine, 100 U / ml de pénicilline) dans un T25 flacon de culture. Placer le flacon de culture dans 5% de CO ₂ incubateur à 37 ° C.
2. Le jour 2, observer la morphologie des cellules au microscope. Les cellules sont....

Results

Au cours du processus de transformation, les changements morphologiques des cellules sont visualisées par microscopie optique (Figure 2). De petites grappes de cellules étaient clairement visibles par le procédé de séparation par gradient de densité au bout de 7 jours après l'infection, alors que seule une couche épaisse de fragments cellulaires sont visibles à partir de la méthode de la lyse des globules rouges. Cependant, des amas de cellules lymphoblastoïdes sont visi.......

Discussion

Nous rapportons ici le développement d'un nouveau procédé d'immortalisation de lymphocytes B humains à partir de sang total par lyse des globules rouges et la viabilité cellulaire établie de B-LCL a été évaluée par le test MTT. Les résultats ont montré que la viabilité des cellules B-LCL établies par la méthode de la lyse des globules rouges est beaucoup plus élevé que celui du procédé de séparation par gradient de densité. L'avantage majeur de la méthode de la lyse des globules rouges est qu'il est simp.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Centrifugeuse	Techcomp	CT6T	Centrifugation
Compteur de cellules automatisé  ;	Countstar	; IC 1000  ;	Pour le comptage cellulaire  ;
Spectrophotomètre de microplaques Epoch	BioTek Instruments	SN263839	Pour mesurer l’absorbance
96 puits cluster de culture cellulaire	Corning Incorporated	3599	Plaques de polystyrène
24 puits cluster de culture cellulaire	Corning Incorporated	3524	Plaques de polystyrène
25 cm2 flacon de culture cellulaire	Nest	707001	Polystyrène& nbsp ;
FBS	Gibco	10270	Composant des B-LCLs medium
RPMI Medium 1640	Gibco	31800-022	Pour les B-LCLs medium
L-Glutamine  ;   ;	Amresco	0374	Composant des B-LCLs moyen
100x streptomycine pénicilline solution BioRoYeeBRY-2309	BioRoYee	BRY-2309	Composant des B-LCLs medium
Ficoll paque plus	GE  ; Soins de santé	17-1440-03	Pour in vitro isolement des lymphocytes
PHA-M	Sigma	L8902	Pour stimuler la prolifération des lymphocytes
Cyclosporin A	Caïmans  ; Produit chimique	12088	Pour inhiber l’effet cytotoxique des lymphocytes T
Tampon de lyse des globules rouges	Tiangen	RT122-01	Pour lyser les globules rouges
MTT	Amresco	0793	Pour la détection de la viabilité cellulaire
DMSO	Sigma	D2650	Pour la congélation des cellules