Выделение эндотелиальных клеток-предшественников от здоровых добровольцев и их миграционном потенциал Под влиянием Образцы сыворотки после кардиохирургии

Summary

Эндотелиальные клетки-предшественники (ЕРС) имеют решающее участие в неоваскуляризации ишемических тканей. Этот метод описывает выделение человека ЕРС из периферической крови, а также выявление их миграционного потенциала в отношении образцов сыворотки хирургических больных сердечными.

Abstract

Эндотелиальные клетки-предшественники (ЕРС) набираются из костного мозга при патологических состояниях, как гипоксии и в решающей степени участвуют в неоваскуляризации ишемических тканей. Происхождение, классификация и характеристика ЕРС являются сложными; Несмотря на это, два известных подтипов ЕРС были созданы: так называемые "ранние" ЕРС (впоследствии называют раннего EPCs) и поздним вырост ЕРС (позднего EPCs). Они могут быть классифицированы по биологическим свойствам, а также по их внешнему виду в процессе культивирования в лабораторных условиях . В то время как "ранние" ЕРС появляются в менее чем через неделю после того, как культуры периферических мононуклеарных клеток крови, полученных в ЕС конкретных средств массовой информации, в конце-отросток ЕРС можно найти через 2-3 недели. Поздний вырост ЕРС были признаны непосредственно участвовать в неоваскуляризации, в основном за счет их способности дифференцироваться в зрелые эндотелиальные клетки, в то время как "ранние" ЕРС выражают различные ангиогенные факторы, как эндогенныхOUs грузов для содействия ангиогенеза в паракринной образом. Во время ишемии миокарда / реперфузии (I / R), различные факторы управления хоминг ЕРС в регионах формирования кровеносных сосудов.

Макрофагами фактор ингибирования миграции (MIF) представляет собой хемокин подобный провоспалительных и повсеместно экспрессируется цитокин и недавно был описан функционировать в качестве ключевого регулятора миграции ЕРС при физиологических концентрациях ^1. Интересно отметить , что MIF хранится в внутриклеточных пулов и может быстро высвобождаться в кровоток после нескольких раздражителей (например , инфаркт миокарда).
Этот протокол описан способ надежной изоляции и культуры раннего ЕРС от взрослых периферической крови человека на основе CD34-позитивной селекции с последующей культуры в среде , содержащей эндотелиальные факторы роста на покрытой фибронектином пластин для использования в ин витро миграции анализов против образцов сыворотки хирургических больных сердечными. Кроме того,мигрирующий влияние MIF на хемотаксис ЕРС по сравнению с другими известными ангиогенеза-стимулирующего цитокинов продемонстрирована.

Introduction

Эндотелиальные клетки – предшественники (ЕРС) циркулируют в крови человека и обладают способностью дифференцироваться в эндотелиальные клетки ^2. Они участвуют в васкулогенезе и способны минимизировать повреждения , вызванные воспалением и ишемии / реперфузии (I / R) травм различными способами ^{3, 4.} Например, ЕРС показывают повышенные уровни внутриклеточных антиоксидантных ферментов , таких как каталазы, глутатионпероксидазы или марганца супероксиддисмутаза (MnSOD) ^5. Повышенная устойчивость к окислительному стрессу позволяет ЕРС функционировать в микросреды с повышенными активных форм кислорода (ROS) после ишемического повреждения ^6. Предыдущие исследования также показали , что количество ЕРС может быть соотнесена с сосудистой ремонта и что снижается количество циркулирующих ЕРС предсказывает возникновение сердечно – сосудистых событий ^7,класс = "Xref"> 8. Однако четкое определение EPC еще не найден. До сих пор нет никакой конкретной клеточной поверхности маркер или последовательным фенотип для ЕРС и эти клетки очень редки в периферической крови ^9. У человека EPC следует рассматривать как циркулирующей клетки с возможностью способствовать восстановлению поврежденного эндотелия и новых сосудистых структур.

Один из способов выделения и характеризующий ЕРС через адгезию к фибронектина. Таким образом, пропускная способность этих клеток используется , чтобы показать превосходную адгезию с фибронектином посуду с покрытием по сравнению с 1 типа коллагена, например , ^{3, 10, 11.} Тем не менее, другие обнаружили , что покрытие мононуклеаров на покрытой фибронектином блюда без предварительной или последующей стадии очистки приводит к колонии в том числе миелоидных клеток – предшественников, моноцитов и Т – лимфоцитов ^{12, 13, 14.} К тому же , в этом случае, тромбоциты могут контаминировать мононуклеарных клеток (МНК) фракции и , таким образом , передача белков плазматической мембраны в каких – либо прилипшие клетки ^15.

Помимо определения характеристик с помощью анализов адгезии в пробирке, сочетание различных маркеров клеточной поверхности используется для описания типа клеток рассматривается как EPC. В этом случае, после того, как фибронектин-опосредованной адгезии, клетки проанализированных в отношении их эндотелий как атрибуты. В этом процессе две эндотелиальных клеток-ассоциированных маркеров, липопротеин ацетилированный-низкой плотности (AcLDL) и сосудистый эндотелиальный фактор роста рецептора 2 (VEGFR-2, KDR), играют определенную роль. Эндотелиальные клетки и макрофаги было показано, в частности , занимают AcLDL в процессе , называемом "поглотитель клеток путь" ^16. Другой маркер белок KDR в качестве основного рецептора VEGF на эндотелиальные¹⁷ клетки. Тем не менее, в качестве ЕРС в целом, культивируют в среде с эндотелиальными факторами роста и фетальной сыворотки теленка, то возможно, что макрофаги, которые, возможно, также были ошибочно изолированы, проявляют профиль маркера эндотелиальной типа. Как было показано ранее, если культивировали в эндотелиальной-кондиционированной среды, макрофаги экспресс "эндотелиальные специфические белки" ^18.

В общем, есть две категории ЕРС в рамках более подтипов, которые могут быть найдены в крови или быть выращены в лабораторных условиях . Поздние-вырост ЕРС (позднего ЕРС) появляются через 2-3 недели культуры. Эти клетки интегрируются быстрее в монослой эндотелиальных клеток пупочной вены человека и могут образовывать капиллярные трубки ^19. К тому же, так называемый "ранний-ЕРС" циркулируют в крови в течение приблизительно одной недели и действовать более пассивным способом посредством доставляющих ангиогенных молекул, таких, как сосудистый эндотелиальный ростфактор (VEGF), или CXCL8 ^19. У пациентов с ишемической болезнью сердца (ИБС) показали значительно меньшее количество раннего ЕРС по сравнению с контрольной группой без CAD ^20. Интересно отметить, что та же группа исследователей показала более высокие количества позднемагматического ЕРС по сравнению с контрольной группой. Другое исследование показало , что раннее-ЕРС защитить дифференцированные ЕРС от апоптоза в окислительных условиях в паракринной образом ^6. Таким образом, ранние ЕРС могли бы обеспечить соответствующие защитные эффекты через миграцию других клеток в авто- или паракринной образом в периферической крови.

Этот протокол описывает метод для очистки раннего ЕРС сначала выделением РВМС фракции из периферической крови человека , а затем выделения клеток CD34 ⁺ из РВМС фракции , чтобы очистить эту суспензию клеток от нежелательных клеток. CD34 представляет собой маркер, который используется для выделения человеческих гемопоэтических стволовых клеток ⁹ </sup>. Затем, CD34 ⁺ клетки культивировали на покрытой фибронектином поверхностей для культивирования тканей. Через три дня, среда изменяется, тем самым теряя все, не прилипшие клетки. И, наконец, изолированные ЕРС окрашивают, чтобы проверить поглощение AcLDL и присутствие KDR как эндотелиальные клетки-маркера с помощью флуоресцентной-Активированный сортировки клеток (FACS). В качестве дополнительного маркера, мы проанализировали тромбоцитов эндотелиальной молекулы клеточной адгезии (РЕСАМ-1, CD31), который также имеет место на эндотелиальных клетках.

Восстановление поврежденных или инфарктом миокарда ткани повышенной вербовке ЕРС относится к интенсивно изучаемых стратегий лечения в сердечно-сосудистых заболеваний. Тем не менее, перевод экспериментальных результатов в клиническую практику до сих пор сложной задачей, учитывая сложный клеточный взаимодействие в организме человека в процессе различных патофизиологических условиях. Кроме того, инфаркт I / травмы R вызывают чрезмерную секрецию различных цитокинов, гормонов и FAC роста торы, которые контролируют хоминг ЕРС в районы формирования кровеносных сосудов ^13. Как уже было показано, CXCL8, стромальных клеток , полученных фактор 1α (SDF-1α, CXCL12), VEGF и фактор , ингибирующий миграцию макрофагов (MIF) значительно увеличены в образцах сыворотки после инфаркта I / R травмы ^1. Среди этих факторов, MIF является плейотропных хемокин-цитокина с преимущественно провоспалительных характеристиками. В отличие от своего исторического названия, MIF имеет про-миграционные функции, действуя как истинный хемокина на различных типах клеток ^{1, 21, 22.} MIF-опосредованные процессы подбора кадров клеток были связаны с рецепторов хемокинов CXCR2 и CXCR4, который MIF связывается и активирует в не родственным образом ^21. Следует отметить, что ЕРС выражают оба этих рецепторов на их поверхности, что дополнительно становятся повышающей регуляции в условиях гипоксиипопка = "Xref"> ^{23, 24.} Кроме того, накапливая данные свидетельствуют о том, что MIF имеет общую кардио-защитный эффект в течение I / R повреждения сердца ^{22, 25, 26.} В этом контексте было далее показано , что MIF может поддерживать неоваскуляризации во время гипоксического стресса , что имеет особое значение при рассмотрении вопроса ограниченные механизмы восстановления травмированной миокарда ^27. Предыдущие исследования в пробирке и эксперименты в доклинических моделях мышей при условии , первые свидетельства о роли MIF в ЕРС наборе ^4. Следует отметить, что MIF также является видным грузовой белок ЕРС , которые могут быть освобождены в ходе ЕРС набора в пределах ишемических участков ^28. Тем не менее, исследования в клинических условиях, в частности, по сравнению с другими (ангиогенеза) в сыворотке крови цитокинов остаются неуловимыми.

Protocol

Кровь для выделения ЕРС был получен от здоровых добровольцев после информированного согласия в соответствии с местным комитетом по этике. Образцы сыворотки, используемые в анализах миграции были получены от пациентов, которые перенесли обычную кардиохирургии с использованием искус?…

Representative Results

Характеристика изолированных эндотелиальных клеток-предшественников Во-первых, поглощение AcLDL верифицирован, а также выражение KDR, и CD31 на поверхности популяции клеток изолированной. Как показано на фиг.7А, 85,1% из выде…

Discussion

Первая часть этого исследования включали в себя изоляцию человека ЕРС из периферической крови здоровых добровольцев, чтобы дать всестороннюю оценку крови больных кардиохирургии. Таким образом, градиент плотности проводили центрифугирование для отделения фракции РВМС из плазмы, гра?…

Materials

Fibronectin	Biochrom AG	L7117	Coating of T-75 flasks
Aqua ad iniectabilia	Fresenius Kabi
Endothelial cell growth medium MV2	Promo Cell	C-22221
Endothelial cell growth medium MV2 SupplementMix	Promo Cell	C-39226
Ficoll-Paque plus	GE Healthcare	17-1440-03	Density centrifugation
EasySep human CD34 positive Selection Kit	Stemcell Technologies	18056	Isolation of CD34+ cells
EasySep magnet	Stemcell Technologies	18000
Accutase	Sigma-Aldrich	A6964-100ML	Detachment of cells
Corning HTS transwell 96 well permeable supports	Sigma-Aldrich	CLS3387-8EA	Migration system
Hoechst solution	ThermoFisher	33342	Staining of migrated cells
ImageJ	National institutes of health	xxx	Counting of migrated cells