JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Medicine

Isolering af endotel progenitorceller fra raske frivillige og deres træk Potential Påvirket af Serum Prøver efter hjertekirurgi

Published: February 14, 2017
doi:
10.3791/55192
, , , , , ,
1Department of Intensive Care Medicine,University Hospital Aachen, 2Institute of Biochemistry and Molecular Biology,University Hospital Aachen, 3Department of Radiology,German Cancer Research Center, 4Department of Thoracic and Cardiovascular Surgery,University Hospital Aachen, 5Department of Vascular Biology, Institute for Stroke and Dementia Research (ISD),Klinikum der Universität München, 6Deutsches Zentrum für Herz-/Kreislaufkrankheiten (DZHK),Munich Heart Alliance

Summary

Endoteliale progenitorceller (EPC'er) er afgørende involveret i neovaskularisering af iskæmiske væv. Denne metode beskriver isolering af menneskelige EPC'er fra perifert blod, samt identifikation af deres vandrende potentiale mod serumprøver af hjerte-kirurgiske patienter.

Abstract

Endoteliale progenitorceller (EPC'er) rekrutteres fra knoglemarven under patologiske tilstande som hypoxi og er afgørende involveret i neovaskularisering af iskæmiske væv. Oprindelsen, klassifikation og karakterisering af EPC'er er komplekse; Uanset, er der etableret to fremtrædende undertyper af EPC'er: såkaldt "tidlige" EPC'er (herefter benævnt tidlige-EPC'er) og sene-udvækst EPC'er (sen-EPC'er). De kan klassificeres ved biologiske egenskaber såvel som af deres udseende under in vitro dyrkning. Mens "tidlige" EPC'er vises i mindre end en uge efter dyrkning af perifert blod-afledte mononucleære celler i EF-specifikke medier, kan sene-udvækst EPC'er findes efter 2-3 uger. Late-udvækst EPC'er er blevet anerkendt for at være direkte involveret i neovaskularisering, primært gennem deres evne til at differentiere til modne endotelceller, mens "tidligt" EPC'er udtrykker forskellige angiogene faktorer som Endogenskellige last til fremme angiogenese i en parakrin måde. Under myocardial iskæmi / reperfusion (I / R), forskellige faktorer styrer målsøgning af EPC'er til områder af blodkar- dannelse.

Makrofag migration inhibitorisk faktor (MIF) er et chemokin-lignende pro-inflammatoriske og ubikvitært cytokin og blev for nylig beskrevet at fungere som central regulator af EPC'er migration ved fysiologiske koncentrationer 1. Interessant er MIF opbevaret i intracellulære puljer og kan hurtigt frigives i blodstrømmen efter flere stimuli (f.eks myokardieinfarkt).
Denne protokol beskriver en fremgangsmåde til pålidelig isolering og dyrkning af tidlige EPC'er fra voksent humant perifert blod baseret på CD34-positiv selektion med efterfølgende dyrkning i medium indeholdende endotelvækstfaktorer på fibronectincoatede plader til anvendelse i in vitro migration assays mod serumprøver af hjerte-kirurgiske patienter. Endviderevandrende indflydelse af MIF på kemotaksi af EPC'er sammenlignet med andre kendte angiogenese-stimulerende cytokiner påvises.

Introduction

Endoteliale progenitorceller (EPC'er) cirkulerer i det menneskelige blod og har evnen til at differentiere til endotelceller 2. De deltager i vaskulogenese og er i stand til at minimere skader forårsaget af betændelse og iskæmi / reperfusion (I / R) skader på forskellige måder 3, 4. For eksempel EPC'er viser forhøjede niveauer af intracellulære antioxidant enzymer såsom katalase, glutathionperoxidase eller mangan superoxid dismutases (MnSOD) 5. Det forhøjede modstand mod oxidativ stress tillader EPC'er at fungere i mikromiljøer med forhøjede reaktive oxygenarter (ROS) efter iskæmisk skade 6. Tidligere undersøgelser viste også, at antallet af EPCs kan være korreleret til vaskulær reparation og at et reduceret antal cirkulerende EPC'er forudsiger forekomsten af kardiovaskulære hændelser 7,class = "xref"> 8. Men er ikke blevet fundet endnu, en klar definition af en EPC. Indtil nu er der ingen specifik celleoverflademarkør eller konsistent fænotype for EPC'er og disse celler er meget sjældne i det perifere blod 9. En menneskelig EPC bør betragtes som en cirkulerende celle med evnen til at bidrage til genopbygningen af ​​de sårede endotel og nye vaskulære strukturer.

En måde at isolere og karakterisere EPC'er er gennem adhæsion til fibronectin. Derved er kapaciteten af disse celler anvendes til at vise en overlegen vedhæftning til fibronectin coatede skåle sammenlignet med type 1 collagen, fx 3, 10, 11. Andre fandt imidlertid, at udplade mononukleære celler på fibronectincoatede retter uden forudgående eller yderligere oprensningstrin fører til kolonier herunder myeloide progenitorceller, monocytter og T-lymfocytter 12, 13, 14. Desuden i dette tilfælde kan blodplader forurene det mononukleære celle (MNC) fraktion og derved overføre plasmamembranproteiner eventuelle adhærente celler 15.

Udover karakterisering gennem in vitro adhæsionsassays, er en kombination af forskellige celleoverflademarkører bruges til at beskrive en celletype betragtes som en EPC. I dette tilfælde, efter fibronectin-medieret adhæsion, cellerne analyseres om deres endoteliale-lignende egenskaber. I denne proces, de to endotheliale celleassocierede markører, acetyleret-lavdensitetslipoprotein (AcLDL) og vaskulær endotelvækstfaktor receptor 2 (VEGFR-2, KDR), spiller en rolle. Endotelceller og makrofager er blevet vist at specifikt tage op AcLDL i en proces kaldet "scavenger celle pathway" 16. Et andet markørprotein er KDR som den vigtigste VEGF-receptor på endotelceller 17. Men som EPC'er i almindelighed dyrkes i medier suppleret med endotelvækstfaktorer og føtalt kalveserum, er det muligt, at makrofager, der muligvis også er blevet fejlagtigt isoleret, udviser en endothelial-lignende markør profil. Som tidligere vist, hvis dyrkes i en endotel-konditioneret medium, makrofager udtrykker "endoteliale-specifik" proteiner 18.

Generelt er der to kategorier af EPC'er inden flere undertyper, som kan findes i blodet eller dyrkes in vitro. Sene-udvækst EPC'er (sen-EPC'er) vises efter 2-3 ugers kultur. Disse celler er integreret hurtigere i et monolag af humane navlestrengsveneendotelceller og kan danne kapillarrør 19. Desuden, såkaldte "early-EPC'er" cirkulerer i blodet i omkring en uge og handle i en mere passiv måde ved at levere angiogene molekyler, såsom vaskulær endotelvækstfaktor(VEGF), eller CXCL8 19. Patienter med koronararteriesygdom (CAD) viste signifikant lavere mængder af tidlige EPC'er sammenlignet med en kontrolgruppe uden CAD 20. Interessant nok viste den samme gruppe større mængder af sene EPC'er sammenlignet med en kontrolgruppe. En anden undersøgelse viste, at tidlig-EPC'er beskytter differentierede EPC'er fra apoptose under oxidative betingelser i en parakrin måde 6. Derfor kan tidlige EPC'er levere relevante beskyttende virkninger gennem migration af andre celler i en auto- eller parakrin måde i perifert blod.

Denne protokol beskriver en fremgangsmåde til oprensning af tidlige EPC'er ved først at isolere PBMC-fraktionen fra humant perifert blod og efterfølgende isolering af CD34 + -celler fra PBMC-fraktionen for at rydde denne cellesuspension fra uønskede celler. CD34 er en markør, som anvendes til isolering af humane hæmatopoietiske stamceller 9 </sup>. Bagefter CD34 + -celler dyrkes på fibronectincoatede vævskulturplader overflader. Efter tre dage, ændres mediet, hvorved de mister alle ikke-adhærente celler. Endelig er isolerede EPC'er farves at kontrollere optagelsen af ​​AcLDL og tilstedeværelsen af ​​KDR som endotelcelle-markør ved anvendelse af fluorescens-aktiveret cellesortering (FACS). Som en ekstra markering, analyserede vi blodplade endotelcelle-adhæsionsmolekyle (PECAM-1, CD31), som også forekommer på endotelceller.

Restaurering af beskadigede eller infarkt myokardie væv ved øget rekruttering af EPC'er hører til de intensivt undersøgte behandlingsstrategier i hjerte-kar-sygdomme. Imidlertid oversættelse af eksperimentelle resultater i klinisk praksis stadig udfordrende på grund af den komplekse cellulære samspil i det menneskelige legeme under forskellige patofysiologiske tilstande. Endvidere myocardial I / R kvæstelser udløse en overdreven sekretion af forskellige cytokiner, hormoner og vækst fac torer, der styrer målsøgning af EPC'er til områder af blodkardannelse 13. Som allerede vist, CXCL8, stromacelle–afledt faktor 1α (SDF-1α, CXCL12), VEGF og makrofag migration inhibitorisk faktor (MIF) er steget betydeligt i serumprøver efter myokardie I / R skade en. Blandt disse faktorer, MIF er en pleiotropisk chemokin-lignende cytokin med overvejende pro-inflammatoriske egenskaber. I modsætning til sin historiske navn, MIF har pro-migrerende funktioner, som en sand chemokin på forskellige celletyper 1, 21, 22. MIF-medierede celle rekruttering processer er blevet knyttet til kemokinreceptorer CXCR2 og CXCR4, der MIF binder til og aktiverer i en ikke-beslægtet måde 21. Notatet EPC'er udtrykker begge disse receptorer på deres overflade, som desuden bliver opreguleret under hypoxiske betingelserass = "xref"> 23, 24. Desuden, akkumulering tyder på, at MIF har en overordnet cardio-beskyttende virkning under I / R skade af hjertet 22, 25, 26. I den forbindelse er det blevet yderligere vist, at MIF kan understøtte neovaskularisering under hypoxisk stress, der er af særlig relevans, når man overvejer de begrænsede inddrivelse mekanismer skadelidte myocardium 27. Tidligere in vitro-undersøgelser og eksperimenter i prækliniske musemodeller forudsat første beviser om den rolle, MIF i EPC'er rekruttering 4. Notatet MIF også er en fremtrædende last protein EPC'er som kan frigives i løbet af EPC'er rekruttering inden iskæmiske steder 28. Men studier i kliniske omgivelser navnlig i sammenligning med andre (angiogene) serumcytokiner forblive undvigende.

Protocol

Blod til isolering af EPC'er blev opnået fra raske frivillige efter informeret samtykke i overensstemmelse med den lokale etiske komité. Serumprøver, der anvendes i migrationen assays blev opnået fra patienter, der undergik konventionel hjertekirurgi med brug af kardiopulmonal bypass (CPB). Eksklusionskriterier var akutte operationer, kendt eller mistænkt graviditet, patientens alder mindre end 18 år, og manglende indhente informeret samtykke. Serumprøver blev udtaget ud over kliniske rutinemæssige målinger…

Representative Results

Karakterisering af Isolerede endotel progenitorceller Først blev optagelsen af ​​AcLDL verificeret, samt ekspressionen af ​​KDR, og CD31 på overfladen af ​​det isolerede cellepopulation. Som figur 7a viser, 85,1% af de isolerede EPC'er viste en optagelse af AcLDL og udtrykte CD31. Figurerne 7b og 7c viser yderligere en homogen fordeling af begge mærker, selv om…

Discussion

Den første del af denne undersøgelse omfattede isolering af menneskelige EPC'er fra det perifere blod fra raske frivillige for at muliggøre en omfattende evaluering af blodet af hjerte kirurgi patienter. Derfor blev en densitetsgradientcentrifugering udført for at separere PBMC-fraktionen fra plasma, granulocytter og erythrocytter. At fjerne det meste af de kontaminerende blodplader, var dette cellefraktion udsættes for korte og langsomme vasketrin 29, 30.</s…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Forfatterne har ingen bekræftelser.

Materials

Fibronectin Biochrom AG L7117 Coating of T-75 flasks
Aqua ad iniectabilia Fresenius Kabi
Endothelial cell growth medium MV2 Promo Cell C-22221
Endothelial cell growth medium MV2 SupplementMix Promo Cell C-39226
Ficoll-Paque plus GE Healthcare 17-1440-03 Density centrifugation
EasySep human CD34 positive Selection Kit Stemcell Technologies 18056 Isolation of CD34+ cells
EasySep magnet Stemcell Technologies 18000
Accutase Sigma-Aldrich A6964-100ML Detachment of cells
Corning HTS transwell 96 well permeable supports Sigma-Aldrich CLS3387-8EA Migration system
Hoechst solution ThermoFisher 33342 Staining of migrated cells
ImageJ National institutes of health xxx Counting of migrated cells
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Emontzpohl, C., et al. Key role of MIF in the migration of endothelial progenitor cells in patients during cardiac surgery. Int J Cardiol. 181C, 284-287 (2014).
  2. Smadja, D. M., et al. Interleukin 8 is differently expressed and modulated by PAR-1 activation in early and late endothelial progenitor cells. J Cell Mol Med. 13 (8B), 2534-2546 (2009).
  3. Asahara, T., et al. Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis. Science. 275 (5302), 964-967 (1997).
  4. Simons, D., et al. Hypoxia-induced endothelial secretion of macrophage migration inhibitory factor and role in endothelial progenitor cell recruitment. J Cell Mol Med. 15 (3), 668-678 (2011).
  5. Dernbach, E., et al. Antioxidative stress-associated genes in circulating progenitor cells: evidence for enhanced resistance against oxidative stress. Blood. 104 (12), 3591-3597 (2004).
  6. Yang, Z., et al. Paracrine factors secreted by endothelial progenitor cells prevent oxidative stress-induced apoptosis of mature endothelial cells. Atherosclerosis. 211 (1), 103-109 (2010).
  7. Asahara, T., Kawamoto, A., Masuda, H. Concise review: Circulating endothelial progenitor cells for vascular medicine. Stem Cells. 29 (11), 1650-1655 (2011).
  8. Schmidt-Lucke, C., et al. Reduced number of circulating endothelial progenitor cells predicts future cardiovascular events: proof of concept for the clinical importance of endogenous vascular repair. Circulation. 111 (22), 2981-2987 (2005).
  9. Yoder, M. C. Human endothelial progenitor cells. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (7), a006692 (2012).
  10. Ito, H., et al. Endothelial progenitor cells as putative targets for angiostatin. Cancer Res. 59 (23), 5875-5877 (1999).
  11. Hill, J. M., et al. Circulating endothelial progenitor cells, vascular function, and cardiovascular risk. N Engl J Med. 348 (7), 593-600 (2003).
  12. Yoder, M. C., et al. Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals. Blood. 109 (5), 1801-1809 (2007).
  13. Rohde, E., et al. Blood monocytes mimic endothelial progenitor cells. Stem Cells. 24 (2), 357-367 (2006).
  14. Rohde, E., et al. Immune cells mimic the morphology of endothelial progenitor colonies in vitro. Stem Cells. 25 (7), 1746-1752 (2007).
  15. Prokopi, M., et al. Proteomic analysis reveals presence of platelet microparticles in endothelial progenitor cell cultures. Blood. 114 (3), 723-732 (2009).
  16. Voyta, J. C., Via, D. P., Butterfield, C. E., Zetter, B. R. Identification and isolation of endothelial cells based on their increased uptake of acetylated-low density lipoprotein. J Cell Biol. 99 (6), 2034-2040 (1984).
  17. Koch, S., Claesson-Welsh, L. Signal transduction by vascular endothelial growth factor receptors. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (7), a006502 (2012).
  18. Hirschi, K. K., Ingram, D. A., Yoder, M. C. Assessing identity, phenotype, and fate of endothelial progenitor cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 28 (9), 1584-1595 (2008).
  19. Hur, J., et al. Characterization of two types of endothelial progenitor cells and their different contributions to neovasculogenesis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 24 (2), 288-293 (2004).
  20. Tagawa, S., et al. Determination of Early and Late Endothelial Progenitor Cells in Peripheral Circulation and Their Clinical Association with Coronary Artery Disease. Int J Vasc Med. , 2015 (2015).
  21. Bernhagen, J., et al. MIF is a noncognate ligand of CXC chemokine receptors in inflammatory and atherogenic cell recruitment. Nat Med. 13 (5), 587-596 (2007).
  22. Stoppe, C., et al. Interaction of MIF Family Proteins in Myocardial Ischemia/Reperfusion Damage and Their Influence on Clinical Outcome of Cardiac Surgery Patients. Antioxid Redox Signal. 23 (11), 865-879 (2015).
  23. Kanzler, I., et al. Differential roles of angiogenic chemokines in endothelial progenitor cell-induced angiogenesis. Basic Res Cardiol. 108 (1), 310 (2013).
  24. Walenta, K. L., Bettink, S., Bohm, M., Friedrich, E. B. Differential chemokine receptor expression regulates functional specialization of endothelial progenitor cell subpopulations. Basic Res Cardiol. 106 (2), 299-305 (2011).
  25. Rassaf, T., Weber, C., Bernhagen, J. Macrophage migration inhibitory factor in myocardial ischaemia/reperfusion injury. Cardiovasc Res. 102 (2), 321-328 (2014).
  26. Stoppe, C., et al. High postoperative blood levels of macrophage migration inhibitory factor are associated with less organ dysfunction in patients after cardiac surgery. Mol Med. 18, 843-850 (2012).
  27. Amin, M. A., et al. Migration inhibitory factor mediates angiogenesis via mitogen-activated protein kinase and phosphatidylinositol kinase. Circ Res. 93 (4), 321-329 (2003).
  28. Kupatt, C., et al. Embryonic endothelial progenitor cells expressing a broad range of proangiogenic and remodeling factors enhance vascularization and tissue recovery in acute and chronic ischemia. FASEB J. 19 (11), 1576-1578 (2005).
  29. Colotta, F., et al. Expression of a monocyte chemotactic cytokine by human mononuclear phagocytes. J Immunol. 148 (3), 760-765 (1992).
  30. Casale, T. B., Kaliner, M. A rapid method for isolation of human mononuclear cells free of significant platelet contamination. J Immunol Methods. 55 (3), 347-353 (1982).
  31. Lewandowska, K., Kaplan, D., Husel, W. CD34 expression on platelets. Platelets. 14 (2), 83-87 (2003).
  32. Stellos, K., et al. Platelet-derived stromal cell-derived factor-1 regulates adhesion and promotes differentiation of human CD34+ cells to endothelial progenitor cells. Circulation. 117 (2), 206-215 (2008).
  33. Thornton, M. A., Poncz, M. In vitro expansion of megakaryocytes from peripheral blood hematopoietic progenitors. Methods Mol Med. 31, 337-345 (1999).
  34. Ivetic, N., et al. Producing megakaryocytes from a human peripheral blood source. Transfusion. 56 (5), 1066-1074 (2016).
  35. Friedrich, E. B., Walenta, K., Scharlau, J., Nickenig, G., Werner, N. CD34-/CD133+/VEGFR-2+ endothelial progenitor cell subpopulation with potent vasoregenerative capacities. Circ Res. 98 (3), e20-e25 (2006).
  36. Wijelath, E. S., et al. Novel vascular endothelial growth factor binding domains of fibronectin enhance vascular endothelial growth factor biological activity. Circ Res. 91 (1), 25-31 (2002).
  37. Hulkower, K. I., Herber, R. L. Cell migration and invasion assays as tools for drug discovery. Pharmaceutics. 3 (1), 107-124 (2011).
  38. Yao, E. H., et al. Effects of the antioxidative beta-blocker celiprolol on endothelial progenitor cells in hypertensive rats. Am J Hypertens. 21 (9), 1062-1068 (2008).
  39. Takahashi, T., et al. Ischemia- and cytokine-induced mobilization of bone marrow-derived endothelial progenitor cells for neovascularization. Nat Med. 5 (4), 434-438 (1999).
  40. Kawamoto, A., et al. Therapeutic potential of ex vivo expanded endothelial progenitor cells for myocardial ischemia. Circulation. 103 (5), 634-637 (2001).
  41. Kim, B. S., et al. Myocardial Ischemia Induces SDF-1alpha Release in Cardiac Surgery Patients. J Cardiovasc Transl Res. 9 (3), 230-238 (2016).
  42. Frangogiannis, N. G., Smith, C. W., Entman, M. L. The inflammatory response in myocardial infarction. Cardiovasc Res. 53 (1), 31-47 (2002).
  43. Zernecke, A., Bernhagen, J., Weber, C. Macrophage migration inhibitory factor in cardiovascular disease. Circulation. 117 (12), 1594-1602 (2008).
  44. White, D. A., et al. Pro-inflammatory action of MIF in acute myocardial infarction via activation of peripheral blood mononuclear cells. PLoS One. 8 (10), e76206 (2013).

Tags

Endothelial Progenitor CellsCardiac SurgeryCell IsolationMigrationCD-34 Positive CellsDensity GradientPeripheral Blood Mononuclear CellsMagnetic BeadsCell CultureAngiogenesisIschemiaRe-perfusion Injury
check_url/55192?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Emontzpohl, C., Simons, D., Kraemer, S., Goetzenich, A., Marx, G., Bernhagen, J., Stoppe, C. Isolation of Endothelial Progenitor Cells from Healthy Volunteers and Their Migratory Potential Influenced by Serum Samples After Cardiac Surgery. J. Vis. Exp. (120), e55192, doi:10.3791/55192 (2017).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image