En fluorescensbaserade lymfocyter analys Lämplig för high-throughput screening av små molekyler
Summary
Vi presenterar i den aktuella studien en ny fluorescensbaserad analys med användning av lymfocyter härledda från en transgen mus. Denna analys är lämplig för high-throughput screening (HTS) av små molekyler utrustade med egenskap av antingen inhibering eller främjande av lymfocytaktivering.
Abstract
High-throughput screening (HTS) är för närvarande stöttepelaren för identifiering av kemiska enheter med förmåga att modulera biokemiska reaktioner eller cellulära processer. Med utvecklingen av bioteknik och den höga translationell potential av små molekyler, har ett antal innovativa metoder i läkemedelsutveckling utvecklats, vilket förklarar den återuppväckta intresse för användning av HTS. Onkologiområdet är för närvarande den mest aktivt forskningsområde för drogscreening, med inga större genombrott gjorts för identifiering av nya immunmodulerande substanser som transplantationsrelaterade komplikationer eller autoimmuna sjukdomar. Här presenterar vi en ny in vitro murina fluorescensbaserade lymfocyter analys enkelt anpassas för identifiering av nya immunmodulerande föreningar. Denna analys använder T- eller B-celler som härrör från en transgen mus, i vilken Nur77 promotom driver uttryck av GFP på T- eller B-cell-receptorstimulering. Eftersom GFP intensitet återspeglar denaktivering / transkriptionell aktivitet av målcellen, definierar vår assay ett nytt verktyg för att studera effekten av given förening (ar) på cellulära / biologiska responser. Till exempel var en primär screening utfördes med användning av 4,398 föreningar i frånvaro av ett "mål hypotes", vilket ledde till identifiering av 160 potentiella träffar som uppvisar immunmodulerande aktiviteter. Således är lämplig för läkemedelsutveckling program utforskar stora kemiska bibliotek före ytterligare in vitro / in vivo-valideringsstudier användningen av denna analys.
Introduction
High throughput screening (HTS) är en beprövad strategi allmänt antagits för identifiering av nya terapeutiska molekyler eller för omplacering av FDA-godkända läkemedel i nya medicinska indikationer. 1 Hittills kan uppnås HTS framgång mätas genom de många tidigare upptäckta droger. Till exempel, används inhibitor lapatinib tyrosinkinaset för behandling av bröstcancer, sitagliptin; en dipeptidylpeptidas-4 (DPP-4) -hämmare som används som ett anti-hyperglykemiskt läkemedlet, och den orala Bcr-Abl-tyrosinkinashämmare dasatinib används för behandling av kronisk myeloisk leukemi representerar några exempel på en lång lista av godkända läkemedel som ursprungligen upptäcktes av HTS. 2 Även om produktiviteten i läkemedelsindustrin har nyligen drabbats av en brist i upptäckten av nya kemiska enheter, kan sannolikheten för en framgångsrik läkemedelsforskning förbättras genom en ökning av antalet preklinisk candidates visar moduler biologiska / biokemiska egenskaper. Följaktligen kan utvecklingen av nya HTS analyser anpassade för fenotypisk screening erbjuder möjligheten att ge viktiga farmakologiska verktyg för upptäckten av nya läkemedels träffar. 3, 4, 5, 6 Dessutom kan HTS nu utföras i en snabbare takt på grund av betydande tekniska omvandlingar under de senaste åren bland annat skräddarsydda flexibla robotinstallationer, nya avläsningsteknik och omfattande miniatyrisering. 2, 7 Bland de faktorer som bidrar till det växande intresset för användningen av fenotypisk screening (aka framåt farmakologi) är uppfattningen att fokusera på funktionella effekter snarare än förenklade reduktionistiska antaganden om molekylära mål (mål baserade screeningprogram / biokemiska reaktioner) är mer troligt att sho w klinisk effekt. Således håller fenotypisk screening löftet att avslöja nya potentiellt terapeutiska föreningar och molekylära vägar som för närvarande icke behandlingsbara sjukdomar. 2
För att korrekt identifiera inhibitorer eller aktivatorer för en given målmolekyl eller cellulär funktion, är en mycket känslig och tillförlitlig analys som krävs för att skilja mellan bona fide träffar och falska positiva. Så, vad som gör en bra analys? Kvaliteten på en given analys måste först bedömas av signal-till-brus-förhållande (reflekteras genom en Z-faktor). 8 andra bör vara tydligt fastställt riktad verkan eller målet på skärmen. Till exempel kan funktionella cellbaserade strategier erbjuda betydande fördelar för receptorscreening i motsats till en analys särskilt utformade för att bedöma ligand-receptorbindning. Anledningen till detta är att den senare metoden inte kan skilja mellan agonist- och antagonistligander.ss = "xref"> 9 Däremot är ett cellbaserat tillvägagångssätt sannolikt att vara mer effektiva som receptorfunktion kan direkt utvärderas i ett biologiskt fenotyp (proliferation, cellcykelstopp, apoptos, och / eller differentieringen). Dock måste det påpekas att biokemiska analyser kan ge betydande fördelar jämfört med fenotypiska analyser som de gör intrång på en specifik intracellulär mål. En väl optimerad biokemisk analys har i allmänhet mindre uppgifter spridning än en fenotypisk screening samtidigt förenkla efteråt utredningar i samband med läkemedlet molekylära verkningsmekanism. Emellertid är den stora nackdelen av mål-baserade eller biokemiska analyser chansen att amplifiera Frekvensen av falskt positiva träffar som kan påverka icke-specifika mål när de testas i ett biologiskt system (förlust av specificiteten ursprungligen studerats i den biokemiska analysen). 10 Även om en väletablerad brytpunkten mellan negativa och positiva träffar kan minimera antalet falska positiva in den primära screeningen, användningen av ett fysiologiskt relevant system för att härma den nativa cellulära miljö såsom intakta celler, hela vävnader eller hela djur fortfarande central för analysens utformning pendeln. Därför möjliggör fenotypisk screening leder upptäckt med önskvärda biologiska / fenotypiska effekter för sjukdomar utan identifierade läkemedelsmål utan förkunskaper om föreningens verksamhet eller verkningsmekanism. 11
Den här studien handlar om utveckling och testning av en optimerad och reproducerbar fenotypisk screening baserad på två viktiga komponenter: en kommersiellt tillgänglig musmodell och en klustrade under familj av kemiska föreningar. Med avseende på djurmodellen, förlitar analysen på användningen av lymfocyter härledda från en musstam (Nur77 GFP) som härbärgerar en bakteriell artificiell kromosom som innehåller en kassett i vilken uttrycket av det grönt fluorescerande protein (GFP) drivs av the Nur77 promotor. 12 Det kännetecknande för denna stimulering är baserad på det faktum att Nur77 är en omedelbar tidig gen uppreglerad efter T-cellreceptor (TCR) eller B-cell receptor (BCR) stimulering. 12 När det gäller screening själva metoden, var en metod som används för att bidra till att undvika screening av triviala analoger samtidigt minimera den tid som behövs för att bedöma ett stort kemiskt bibliotek (> 10 5 föreningar). För att göra detta, var en databas av kemiska föreningar valda av läkemedelskemister använder virtuella screeningverktyg utnyttjas för att identifiera topologiskt liknande föreningar med hjälp av kända aktiva utsäde strukturer som referenser. Detta tillvägagångssätt tillät oss att screena 4,398 föreningar som representerar en total bibliotek med över 136 tusen kemiska enheter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Flera avläsnings metoder har utnyttjats för utveckling av känsliga och pålitliga HTS-analyser. Dessa inkluderar kolorimetriska, luminiscerande eller fluorescerande metoder. Även om kolorimetriska metoder är enkla att installera, kräver de flera tillsatser av kemikalier, som kan störa eller störa cellerna testas. 23 Dessutom har de inte tillåta dynamisk bedömning av ett biologiskt svar som den farmakologiska effekten bedöms vid en specifik endpoint. Dessutom kan denna metod kräver dyr…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av Merck Frosst Start-up medel från Université de Montréal. Vi vill tacka Dr. Jean Duchaine och Dominic Salois från hög kapacitet plattform vid Institutet för forskning i immunologi och cancer för deras diskussion, kommentarer och återkopplingar. Moutih Rafei har en Fonds de la Recherche en Santé du Québec Junior 1 Award.
Materials
| Nur77GFP mice | The Jackson Laboratory | Mouse strain No. 016617 | An in house colony was established at our animal facility |
| 96 wells-U culture plates, sterile | VWR International | 10062-902 | T-cell activation using the magnetic beads |
| 70µm cell strainer, sterile | Corning Inc. | 352350 | Generation of splenocytes cell suspension |
| 5 ml polystyrene round bottom tubes, sterile | Corning Inc. | 352058 | Generation of splenocytes cell suspension |
| 50 ml polypropylene conical bottom tubes, sterile | VWR International | 89039-656 | Generation of splenocytes cell suspension |
| 10 ml syringe without needle, sterile | Becton, Dickinson and Company | 305482 | To mash the spleen |
| T-25 culture flask | Greiner Bio-One | 690 175 | To incudabte B cells during activation |
| 5 ml cell culture dish, sterile | Greiner Bio-One | 627 160 | To mash the spleen |
| Penicillin- Streptomycin (10,000 U/mL) | WISENT Inc. | 450-200-EL | Component of the splenocyte media |
| RPMI 1600 with sodium bicarbonate and L- glutamine | WISENT Inc. | 350-002-CL | Component of the splenocyte media |
| MEM non-essential amino acids | WISENT Inc. | 321-010-EL | Component of the splenocyte media |
| HEPES free acid 1 M | WISENT Inc. | 330-050-EL | Component of the splenocyte media |
| Sodium pyruvate solution (100mM) | WISENT Inc. | 600-110-EL | Component of the splenocyte media |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | WISENT Inc. | 080-910 | Component of the splenocyte media and flow-cytometry buffer |
| Phosphate buffered saline (PBS) | WISENT Inc. | 311-010-CL | Component of flow-cytometry buffer |
| 2-Mercaptoethanol (55mM) | Thermo Fisher Scientific | 21985-023 | Component of the splenocyte media |
| T- Cells isolation kit | Stemcell Technologies | 19851 | To isolate T cells |
| B- Cells isolation kit | Stemcell Technologies | 19854 | To isolate B cells |
| Mouse T-Activator CD3/CD28 superparamagnetic beads | Thermo Fisher Scientific | 11452D | To activate T cells |
| Cell isolation magnet | Stemcell Technologies | 18000 | To isolate T cells and remove the magnetic beads |
| AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG + IgM (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. | 115-006-068 | To stimulate B cells |
| Recombinant Murine IL-7 | Peprotech | 217-17 | To support T-cell survival during activation |
| Recombinant CD40L | R&D Systems | 8230-CL/CF | To stimulate B cells |
| Anti-mouse CD3 antibody | BD Pharmingen | 561799 | To stain T cells for flow-cytometry |
| Anti-mouse CD19 antibody | BD Pharmingen | 553786 | To stain B cells for flow-cytometry |
| Biomed FXp | PerkinElmer Inc. | A31842 | To re-suspend cells after 24 hours incubation |
| Opera Phenix High Content Screening System | PerkinElmer Inc. | HH14000000 | To analyze GFP/Hoechst signal |
References
- Swinney, D. C., Anthony, J. How were new medicines discovered. Nat Rev Drug Discov. 10 (7), 507-519 (2011).
- Macarron, R., et al. Impact of high-throughput screening in biomedical research. Nat Rev Drug Discov. 10 (3), 188-195 (2011).
- Lokey, R. S. Forward chemical genetics: progress and obstacles on the path to a new pharmacopoeia. Curr Opin Chem Biol. 7 (1), 91-96 (2003).
- Hall, S. E. Chemoproteomics-driven drug discovery: addressing high attrition rates. Drug Discov Today. 11 (11-12), 495-502 (2006).
- Pruss, R. M. Phenotypic screening strategies for neurodegenerative diseases: a pathway to discover novel drug candidates and potential disease targets or mechanisms. CNS Neurol Disord Drug Targets. 9 (6), 693-700 (2010).
- St Onge, R., Schlecht, U., Scharfe, C., Evangelista, M. Forward chemical genetics in yeast for discovery of chemical probes targeting metabolism. Molecules. 17 (11), 13098-13115 (2012).
- Houston, J. G., Banks, M. N., Binnie, A., Brenner, S., O’Connell, J., Petrillo, E. W. Case study: impact of technology investment on lead discovery at Bristol-Myers Squibb. Drug Discov Today. 13 (1-2), 44-51 (2008).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J Biomol Screen. 4 (2), 67-73 (1999).
- Walters, W. P., Namchuk, M. Designing screens: how to make your hits a hit. Nat Rev Drug Discov. 2 (4), 259-266 (2003).
- Zheng, W., Thorne, N., McKew, J. C. Phenotypic screens as a renewed approach for drug discovery. Drug Discov Today. 18 (21-22), 1067-1073 (2013).
- Malo, N., Hanley, J. A., Cerquozzi, S., Pelletier, J., Nadon, R. Statistical practice in high-throughput screening data analysis. Nat Biotechnol. 24 (2), 167-175 (2006).
- Moran, A. E., et al. T cell receptor signal strength in Treg and iNKT cell development demonstrated by a novel fluorescent reporter mouse. J Exp Med. 208 (6), 1279-1289 (2011).
- Kovacic, N., Müthing, J., Marusic, A. Immunohistological and Flow Cytometric Analysis of Glycosphingolipid Expression in Mouse Lymphoid Tissues. J Histochem Cytochem. 48, 1677-1689 (2000).
- Shapiro, H. M. Flow cytometric estimation of DNA and RNA content in intact cells stained with hoechst 33342 and pyronin Y. Cytometry. 2, 143-150 (1981).
- Zanella, F., Lorens, J. B., Link, W. High content screening: seeing is believing. Trends Biotechnol. 28 (5), 237-245 (2010).
- An, W. F. Fluorescence-based assays. Methods Mol Biol. 486, 97-107 (2009).
- Kishimoto, H., Sprent, J. Strong TCR ligation without costimulation causes rapid onset of Fas-dependent apoptosis of naive murine CD4+ T cells. J Immunol. 163 (4), 1817-1826 (1999).
- Schluns, K. S., Kieper, W. C., Jameson, S. C., Lefrancois, L. Interleukin-7 mediates the homeostasis of naive and memory CD8 T cells in vivo. Nat Immunol. 1 (5), 426-432 (2000).
- Jiang, Q., et al. Cell biology of IL-7, a key lymphotrophin. Cytokine Growth Factor Rev. 16 (4-5), 513-533 (2005).
- Koenen, P., et al. Mutually exclusive regulation of T cell survival by IL-7R and antigen receptor-induced signals. Nat Commun. 4, 1735 (2013).
- Vella, A., Teague, T. K., Ihle, J., Kappler, J., Marrack, P. Interleukin 4 (IL-4) or IL-7 prevents the death of resting T cells: stat6 is probably not required for the effect of IL-4. J Exp Med. 186 (2), 325-330 (1997).
- Hawkins, C. J., Vaux, D. L. The role of the Bcl-2 family of apoptosis regulatory proteins in the immune system. Semin Immunol. 9 (1), 25-33 (1997).
- Sumantran, V. N. Cellular chemosensitivity assays: an overview. Methods Mol Biol. 731, 219-236 (2011).
- Huh, S., et al. A cell-based system for screening hair growth-promoting agents. Arch Dermatol Res. 301 (5), 381-385 (2009).
- Weiss, A. TCR signal transduction: opening the black box. J Immunol. 183 (8), 4821-4827 (2009).
- Noel, P. J., Boise, L. H., Green, J. M., Thompson, C. B. CD28 costimulation prevents cell death during primary T cell activation. J Immunol. 157 (2), 636-642 (1996).
- Michels, A. W., et al. Structure-based selection of small molecules to alter allele-specific MHC class II antigen presentation. J Immunol. 187 (11), 5921-5930 (2011).
