Murine Aortic Crush Skade: En Effektiv<em> In vivo</em> Model af smidig muskelcelle proliferation og endotelfunktion
Summary
Restenose efter kardiovaskulære procedurer (bypass-kirurgi, angioplastik eller stenting) er et signifikant problem, der reducerer holdbarheden af disse procedurer. En ideel terapi ville inhibere proliferation af glat muskelcelle (VSMC), samtidig med at der fremmes regenerering af endotelet. Vi beskriver en model til samtidig vurdering af VSMC proliferation og endotelfunktion in vivo.
Abstract
Arteriel rekonstruktion, hvad enten det drejer sig om angioplastik eller bypass-kirurgi, involverer iatrogen traume, der forårsager endotelafbrydelse og vasculær glat muskelcelle (VSMC) proliferation. Almindelige murine modeller studerer små fartøjer som carotid og lårarterier. Heri beskriver vi et in vivo system, hvor både VSMC proliferation og endothelial barrierefunktion kan vurderes samtidigt i en stor beholder. Vi undersøgte infrarenal aorta respons på skade hos C57BL / 6 mus. Aorta blev skadet fra venstre renalven til aorta-bifurcationen med 30 transmurale knusninger af 5 sekunder lang varighed med en bomuldsspidsapplikator. Morfologiske ændringer blev vurderet med konventionel histologi. Aorta vægtykkelse blev målt fra luminale overflade til adventitia. EdU-integration og counter-farvning med DAPI og alpha-actin blev anvendt til at demonstrere VSMC proliferation. Aktivering af ERK1 / 2, en kendt moderator for intimal hyperplasi dannelse, blev afskrækketMined ved Western Blot-analyse. Virkningen af inflammation blev bestemt ved immunhistokemi for B-celler, T-celler og makrofager . En ansigtsafsnit af endothel blev visualiseret med scanningselektronmikroskopi (SEM). Endotelbarrierefunktionen blev bestemt med Evans Blue-farvning. Transmural skade resulterede i aorta vægtykkelse. Denne skade inducerede VSMC proliferation mest prominente ved 3 dage efter skade og tidlig aktivering af ERK1 / 2 og nedsat p27 kip1 ekspression. Skader resulterede ikke i forøget B-celler, T-celler eller makrofager infiltration i beholdervæggen. Skader forårsagede delvis endotelcelle denudation og tab af cellecellekontakt. Skader resulterede i et signifikant tab af endotelbarrierefunktionen, som returnerede til baseline efter syv dage. Den murine transmurale stump aorta skadesmodel tilvejebringer et effektivt system til samtidig undersøgelse af både VSMC proliferation og endotelbarrierefunktion i en stor beholder.
Introduction
restenose Følgende kardiovaskulære procedurer (bypass-operation, angioplastik eller stenting) er et signifikant problem, der reducerer holdbarheden af disse procedurer. Alle revaskulariseringsprocedurer er plaget af restenose. Nuværende strategier til forebyggelse af restenose (lægemiddeleluerende stents og lægemiddelcoatede balloner) hæmmer både vaskulær glatmuskelcelle (VSMC) og endotelcelleproliferation (EC). Følgelig forhindrer disse interventioner VSMC-medieret restenose, men forhindrer også regenerering af endotelet. Uden intakt endotel skal patienter være på stærke antiplatelet midler for at mindske risikoen for in situ trombose med risiko for blødningskomplikationer. En ideel terapi ville inhibere VSMC proliferation samtidig med at regenerering af endotelet. Der er således et behov for samtidig undersøgelse af VSMC proliferation og endotelbarrierefunktion i n vivo .
I øjeblikket er der alvorligeAl musemodeller af restenose 1 . Disse modeller indbefatter carotidligering og femoral arterie ledningsskade 2 . Aorta modeller omfatter stent placering 3 , ballon skade 4 og aorta allograft 5 . Alle de nuværende modeller er begrænsede. Carotidligering genererer en strømningsmedieret neointimal læsion og har ikke endotelskader. Derudover har både carotid- og femorale arterier mange gange færre cellelag end humane fartøjer, hvilket begrænser deres translationsværdi. Mus aorta, som er ca. 1,3 mm i diameter, er det eneste skib, der nærmer sig en klinisk relevant (kranset) human arterie (3).
På trods af translationspotentialet hos murine aorta-modeller af sygdom har nuværende modeller begrænsninger. Disse modeller kræver avancerede mikrokirurgiske færdigheder og specialudstyr som angioplastikballoner og stenter. Her præsenterer viEn ny reproducerbar teknik til samtidig at inducere VSMC proliferation og forstyrre endotelbarrierefunktionen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi har karakteriseret virkningerne af en murin aorta skadesmodel, der resulterer i medial hyperplasi og endotel barriere dysfunktion. Delvis EC-frigørelse langs aorta-intima ledsaget af tabet af cellecellekontakt og forbedring af cellefremspring. Tilsvarende var endotelbarrierefunktionen signifikant svækket, hvilket stimulerede de mitogenfølsomme signaleringsveje, hvilket førte til proliferation af VSMC'er og fortykkelse af beholdervæggen. Styrken i denne model er, at det er teknisk lettere at lære og udføre …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Hsia Ru-ching Ph.D., fra Electron Microscopy Core Facility ved University of Maryland School of Medicine, for hendes tekniske support til behandling af scanning elektroniske mikroskopi prøver.
Materials
| Ocular lubricant | Dechra | 17033-211-38 | Pharmaceutical agents |
| Isoflurane | VetOne | 502017 | Pharmaceutical agents |
| Carprofen | Zoetis | 26357 | Pharmaceutical agents |
| Precision vaporizer | Summit Medical | 10675 | Surgical supplies |
| Charcoal scavenger | Bickford Inc. | 80120 | Surgical supplies |
| Isothermal pad | Harvard Apparatus | 50-7053-R | Surgical supplies |
| Sterile cotton-tipped applicator | Fisher Scientific | 23-400-124 | Surgical supplies |
| 4-0 absorbable monofilament suture | Ethicon, Inc | J310 | Surgical supplies |
| 5-0 non-absorbable monofilament suture | Ethicon,Inc | 1666 | Surgical supplies |
| 21-gauge x 1 inch needle | BD Biosciences | 305165 | Surgical supplies |
| 25-gauge x 1 inch needle | BD Biosciences | 305125 | Surgical supplies |
| Dry sterilizer | Cellpoint | 7770 | Surgical supplies |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14058-09 | Surgical instruments |
| Adson forceps | Fine Science Tools | 11006-12 | Surgical instruments |
| Dumont #5 fine forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | Surgical instruments |
| Vannas Spring Scissors 3mm cutting edge | Fine Science Tools | 15000-00 | Surgical instruments |
| Needle driver | Fine Science Tools | 91201-13 | Surgical instruments |
| Scalpel handle #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | Surgical instruments |
| Scalpel blades #10 | Fine Science Tools | 10010-00 | Surgical instruments |
| PBS | Lonza | 17-516F | Reagents for tissue processing |
| Evans Blue | Sigma-Aldrich | E2129 | Reagents for tissue processing |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Reagents for tissue processing |
| Modeling wax | Bego | 40001 | Reagents for tissue processing |
| OCT compound | Tissue-Tek Sakura | 4583 | Reagents for tissue processing |
| Mayer's hematoxylin solution | Sigma-Aldrich | MHS16 | Reagents for immunohistological analysis |
| Eosin Y solution alcoholic | Sigma-Aldrich | HT110316 | Reagents for immunohistological analysis |
| Elastin stain kit | Sigma-Aldrich | HT25A | Reagents for immunohistological analysis |
| Click-it Edu Alexa-488 Imaging Kit | Invitrogen | C10337 | Reagents for immunohistological analysis |
| Anti-Erk1/2 antibody | Cell Signaling Technology | 4695 | Reagents for immunohistological analysis |
| Anti-phospho-Erk1/2 antibody | Cell Signaling Technology | 4370 | Reagents for immunohistological analysis |
| Anti-p27kip1 antibody | Cell Signaling Technology | 3698 | Reagents for immunohistological analysis |
| Trichloroacetic acid | Sigma-Aldrich | T9159 | Reagents for immunohistological analysis |
References
- Carmeliet, P. Mechanisms of angiogenesis and arteriogenesis. Nat Med. 6 (4), 389-395 (2000).
- Carmeliet, P., Moons, L., Collen, D. Mouse models of angiogenesis, arterial stenosis, atherosclerosis and hemostasis. Cardiovasc Res. 39 (1), 8-33 (1998).
- Baker, A. B., et al. Heparanase Alters Arterial Structure, Mechanics, and Repair Following Endovascular Stenting in Mice. Circ Res. 104 (3), 380-387 (2009).
- Petrov, L., Laurila, H., Hayry, P., Vamvakopoulos, J. E. A mouse model of aortic angioplasty for genomic studies of neointimal hyperplasia. J Vasc Res. 42 (4), 292-300 (2005).
- Li, J., et al. Vascular smooth muscle cells of recipient origin mediate intimal expansion after aortic allotransplantation in mice. Am J Path. 158 (6), 1943-1947 (2001).
- Radu, M., Chernoff, J. An in vivo assay to test blood vessel permeability. J Vis Exp. (73), e50062 (2013).
- Turbett, G. R., Sellner, L. N. The use of optimal cutting temperature compound can inhibit amplification by polymerase chain reaction. Diagn Mol Pathol. 6 (5), 298-303 (1997).
- Puchtler, H., Waldrop, F. S. On the mechanism of Verhoeff’s elastica stain: a convenient stain for myelin sheaths. Histochem. 62 (3), 233-247 (1979).
- Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (7), 2415-2420 (2008).
- Nelson, P. R., Yamamura, S., Mureebe, L., Itoh, H., Kent, K. C. Smooth muscle cell migration and proliferation are mediated by distinct phases of activation of the intracellular messenger mitogen-activated protein kinase. J Vasc Surg. 27 (1), 117-125 (1998).
- Rzucidlo, E. M. Signaling pathways regulating vascular smooth muscle cell differentiation. Vascular. 17, S15-S20 (2009).
- Aoki, T., Sumii, T., Mori, T., Wang, X., Lo, E. H. Blood-brain barrier disruption and matrix metalloproteinase-9 expression during reperfusion injury: mechanical versus embolic focal ischemia in spontaneously hypertensive rats. Stroke. 33 (11), 2711-2717 (2002).
- Yu, D., et al. MARCKS Signaling Differentially Regulates Vascular Smooth Muscle and Endothelial Cell Proliferation through a KIS-, p27kip1- Dependent Mechanism. PLoS One. 10 (11), e0141397 (2015).
- Banai, S., et al. Rabbit ear model of injury-induced arterial smooth-muscle cell-proliferation – kinetics, reproducibility, and implications. Circ Res. 69 (3), 748-756 (1991).
