Murine Aortic Crush Injury: Eine effiziente<em> In vivo</em> Modell der glatten Muskelzellproliferation und Endothelfunktion
Summary
Restenose nach Herz-Kreislauf-Verfahren (Bypass-Chirurgie, Angioplastie oder Stenting) ist ein wichtiges Problem der Verringerung der Haltbarkeit dieser Verfahren. Eine ideale Therapie würde die Proliferation der glatten Muskelzelle (VSMC) hemmen und gleichzeitig die Regeneration des Endothels fördern. Wir beschreiben ein Modell zur gleichzeitigen Beurteilung der VSMC-Proliferation und Endothelfunktion in vivo.
Abstract
Arterielle Rekonstruktion, ob Angioplastie oder Bypass-Operation, beinhaltet iatrogenes Trauma verursacht endotheliale Störung und vaskuläre glatte Muskelzelle (VSMC) Proliferation. Gemeinsame murine Modelle studieren kleine Gefäße wie die Carotis- und Oberschenkelarterien. Hier beschreiben wir ein in vivo- System, in dem sowohl die VSMC-Proliferation als auch die endotheliale Barrierefunktion gleichzeitig in einem großen Gefäß beurteilt werden können. Wir untersuchten die infrarenale Aortenreaktion auf Verletzungen in C57BL / 6 Mäusen. Die Aorta wurde von der linken Nierenvene zur Aortenbifurkation durch 30 transmurale Quetschungen von 5 Sekunden Dauer mit einem Baumwollspitzapplikator verletzt. Morphologische Veränderungen wurden mit konventioneller Histologie beurteilt. Die Aorta-Wanddicke wurde von der Lumenoberfläche bis zur Adventitia gemessen. EdU-Integration und Gegenfärbung mit DAPI und Alpha-Actin wurde zur Demonstration der VSMC-Proliferation verwendet. Die Aktivierung von ERK1 / 2, ein bekannter Moderator der intimalen Hyperplasiebildung, wurde abgebautAbgebaut durch Western-Blot-Analyse. Die Wirkung der Entzündung wurde durch Immunhistochemie für B-Zellen, T-Zellen und Makrophagen bestimmt . En- Gesichtsabschnitte von Endothel wurden mit Rasterelektronenmikroskopie (SEM) visualisiert. Die endotheliale Barrierefunktion wurde mit Evans Blue Färbung bestimmt. Transmurale Verletzungen führten zu Aortenwandverdickung. Diese Verletzung induzierte die VSMC-Proliferation, am deutlichsten bei 3 Tagen nach Verletzung und die frühzeitige Aktivierung von ERK1 / 2 und verringerte die p27- kip1- Expression. Verletzung führte nicht zu erhöhten B-Zellen, T-Zellen oder Makrophagen Infiltration in der Gefäßwand. Verletzung verursacht partielle Endothelzell-Entblößung und Verlust von Zell-Zell-Kontakt. Verletzung führte zu einem signifikanten Verlust der endothelialen Barriere-Funktion, die nach 7 Tagen zur Grundlinie zurückkehrte. Das murine transmurale stumpfe Aortenverletzungsmodell bietet ein effizientes System, um gleichzeitig sowohl die VSMC-Proliferation als auch die endotheliale Barrierefunktion in einem großen Gefäß zu studieren.
Introduction
Restenose Nach Herz-Kreislauf-Verfahren (Bypass-Chirurgie, Angioplastie oder Stenting) ist ein erhebliches Problem der Verringerung der Haltbarkeit dieser Verfahren. Alle Revaskularisierungsverfahren werden durch Restenose geplagt. Gegenwärtige Strategien zur Verhinderung von Restenose (Arzneimittel-eluierende Stents und drogenbeschichtete Ballons) hemmen sowohl die vaskuläre glatte Muskelzelle (VSMC) als auch die endotheliale Zellproliferation (EC). Folglich verhindern diese Interventionen eine VSMC-vermittelte Restenose, verhindern aber auch die Regeneration des Endothels. Ohne ein intaktes Endothel sind die Patienten verpflichtet, auf potenten Antithrombozytenagenten zu sein, um das Risiko einer in situ-Thrombose zu verringern, um die Komplikationen zu bluten. Eine ideale Therapie würde die VSMC-Proliferation hemmen und gleichzeitig die Regeneration des Endothels fördern. Somit besteht die Notwendigkeit, gleichzeitig die VSMC-Proliferation und die endotheliale Barrierefunktion i n vivo zu studieren.
Jetzt gibt es severAl Mausmodelle der Restenose 1 . Diese Modelle beinhalten Karotisligatur und Femoralarterienverletzung 2 . Aortenmodelle umfassen Stent-Platzierung 3 , Ballonverletzung 4 und Aortenallotransplantat 5 . Alle aktuellen Modelle sind begrenzt. Carotis-Ligation erzeugt eine fließvermittelte neointimale Läsion und hat keine endotheliale Verletzung. Darüber hinaus haben sowohl Carotis- als auch Oberschenkelarterien vielfach weniger Zellschichten als menschliche Gefäße, was ihren Translationswert begrenzt. Die Mausaorta, die etwa 1,3 mm im Durchmesser ist, ist das einzige Gefäß, das eine klinisch relevante (koronare) menschliche Arterie (3) annähert.
Trotz des translationalen Potenzials von murinen Aortenmodellen der Erkrankung haben aktuelle Modelle Einschränkungen. Diese Modelle erfordern fortgeschrittene mikrochirurgische Fähigkeiten und spezialisierte Ausrüstung wie Angioplastie Ballons und Stents. Hier präsentieren wirEine neuartige, reproduzierbare Technik, um gleichzeitig die VSMC-Proliferation zu induzieren und die endotheliale Barrierefunktion zu stören.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir haben die Auswirkungen eines murinen Aortenverletzungsmodells charakterisiert, das zu medialer Hyperplasie und endothelialer Barriere-Dysfunktion führt. Die partielle EC-Ablösung entlang der Aorta intima begleitete den Verlust des Zell-Zell-Kontakts und die Verbesserung der Zellvorsprünge. Entsprechend wurde die endotheliale Barrierefunktion signifikant beeinträchtigt, was die mitogenempfindlichen Signalwege stimulierte, was zur Proliferation von VSMCs und Verdickung der Gefäßwand führte. Die Stärken dieses …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Hsia Ru-ching PhD, von der Electron Microscopy Core Facility der University of Maryland School of Medicine, für ihre technische Unterstützung bei der Verarbeitung der Scanning-elektronischen Mikroskop-Proben.
Materials
| Ocular lubricant | Dechra | 17033-211-38 | Pharmaceutical agents |
| Isoflurane | VetOne | 502017 | Pharmaceutical agents |
| Carprofen | Zoetis | 26357 | Pharmaceutical agents |
| Precision vaporizer | Summit Medical | 10675 | Surgical supplies |
| Charcoal scavenger | Bickford Inc. | 80120 | Surgical supplies |
| Isothermal pad | Harvard Apparatus | 50-7053-R | Surgical supplies |
| Sterile cotton-tipped applicator | Fisher Scientific | 23-400-124 | Surgical supplies |
| 4-0 absorbable monofilament suture | Ethicon, Inc | J310 | Surgical supplies |
| 5-0 non-absorbable monofilament suture | Ethicon,Inc | 1666 | Surgical supplies |
| 21-gauge x 1 inch needle | BD Biosciences | 305165 | Surgical supplies |
| 25-gauge x 1 inch needle | BD Biosciences | 305125 | Surgical supplies |
| Dry sterilizer | Cellpoint | 7770 | Surgical supplies |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14058-09 | Surgical instruments |
| Adson forceps | Fine Science Tools | 11006-12 | Surgical instruments |
| Dumont #5 fine forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | Surgical instruments |
| Vannas Spring Scissors 3mm cutting edge | Fine Science Tools | 15000-00 | Surgical instruments |
| Needle driver | Fine Science Tools | 91201-13 | Surgical instruments |
| Scalpel handle #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | Surgical instruments |
| Scalpel blades #10 | Fine Science Tools | 10010-00 | Surgical instruments |
| PBS | Lonza | 17-516F | Reagents for tissue processing |
| Evans Blue | Sigma-Aldrich | E2129 | Reagents for tissue processing |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Reagents for tissue processing |
| Modeling wax | Bego | 40001 | Reagents for tissue processing |
| OCT compound | Tissue-Tek Sakura | 4583 | Reagents for tissue processing |
| Mayer's hematoxylin solution | Sigma-Aldrich | MHS16 | Reagents for immunohistological analysis |
| Eosin Y solution alcoholic | Sigma-Aldrich | HT110316 | Reagents for immunohistological analysis |
| Elastin stain kit | Sigma-Aldrich | HT25A | Reagents for immunohistological analysis |
| Click-it Edu Alexa-488 Imaging Kit | Invitrogen | C10337 | Reagents for immunohistological analysis |
| Anti-Erk1/2 antibody | Cell Signaling Technology | 4695 | Reagents for immunohistological analysis |
| Anti-phospho-Erk1/2 antibody | Cell Signaling Technology | 4370 | Reagents for immunohistological analysis |
| Anti-p27kip1 antibody | Cell Signaling Technology | 3698 | Reagents for immunohistological analysis |
| Trichloroacetic acid | Sigma-Aldrich | T9159 | Reagents for immunohistological analysis |
References
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