Murine אבי העורקים למחוץ פגיעה: יעיל<em> בויבו</em> מודל של תאים שרירים חלקה תפוצת ו אנדותל פונקציה
Summary
Restenosis לאחר הליכים Cardiovascular (ניתוח מעקף, אנגיופלסטיקה, או stenting) היא בעיה משמעותית להפחית את עמידות של נהלים אלה. טיפול אידיאלי יהיה לעכב תפוצת שריר חלקה (VSMC) תוך קידום התחדשות האנדותל. אנו מתארים מודל להערכה סימולטנית של התפשטות VSMC ותפקוד האנדותל in vivo.
Abstract
שחזור עורקי, בין אם ניתוח אנגיופלסטי או ניתוח מעקף, כולל טראומה יאטרוגנית הגורמת לשיבוש אנדותל ותפוצת תאי שריר חלקה (VSMC). מודלים מורין משותף ללמוד כלי קטן כגון עורקי הראש ואת עורקי הירך. להלן אנו מתארים מערכת vivo שבו שתי התפשטות VSMC ו פונקציה מחסום האנדותל ניתן להעריך בו זמנית בכלי גדול. למדנו את התגובה העורקים infrarenal לפציעה C57BL / 6 עכברים. אבי העורקים נפגעו מהוריד הכליתי השמאלי עד לשתי ההתהוות של אבי העורקים על ידי 30 ריסקות טרנסמומיות של משך 5 שניות עם מוליך כותנה. שינויים מורפולוגיים הוערכו עם היסטולוגיה קונבנציונלית. עובי דופן העורקים נמדד מן המשטח לומינליטיה. שילוב EDU וכתמים נגד עם DAPI ואלפא אקטין שימש להדגים התפשטות VSMC. הפעלת ERK1 / 2, מנחה ידוע של היווצרות היפרפלזיה אינטימית, הרתיעהממוקש על ידי ניתוח כתם המערבי. ההשפעה של דלקת נקבע על ידי אימונוהיסטוכימיה עבור תאים B, T- תאים, ומקרופאגים . En פנים קטעים של האנדותל היו דמיינו עם מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה (SEM). פונקציה אנדותל המכשול נקבע עם מכתים Evans כחול. פגיעה בחצי הדם גרמה לעיבוי קיר העורקים. פגיעה זו גרמה להתפשטות VSMC, הבולט ביותר ב 3 ימים לאחר הפציעה, ואת ההפעלה המוקדמת של ERK1 / 2 ו ירד p27 ביטוי kip1. פגיעה לא הביאה לגידול בתאי B, תאי T, או חדירת מקרופאגים בקיר הספינה. פציעה גרמה למחלות תא אנדותליות חלקיות ולאובדן מגע של תאים תאיים. פגיעה גרמה לאובדן משמעותי של תפקוד מחסום האנדותל, אשר חזר לקו הבסיס לאחר שבעה ימים. Murine transmural בוטה אב העורקים מודל הפציעה מספקת מערכת יעילה כדי ללמוד בו זמנית הן התפשטות VSMC ו מחסום אנדותל פונקציה בכלי גדול.
Introduction
רסטנוזה ניתוח מעקפים (ניתוח מעקפים, אנגיופלסטיקה או סטנט) הוא בעיה משמעותית בהפחתת עמידותם של תהליכים אלה. כל ההליכים רה-וסקולריזציה הם מנוגע על ידי restenosis. האסטרטגיות הנוכחיות למניעת רסטנוזיס (סטנטים משחררים תרופה ובלונים מצופים בסמים) מעכבים את תאי השריר החלקים של כלי הדם (VSMC) ואת התפשטות תאי האנדותל (EC). כתוצאה מכך, התערבויות אלה למנוע restenosis מתווך VSMC, אלא גם למנוע את התחדשות האנדותל. ללא אנדותל שלם, החולים נדרשים להיות על סוכנים נוגדי טסיות חזק כדי להקטין את הסיכון של פקקת באתרו בסיכון של דימום סיבוכים. טיפול אידיאלי יהיה לעכב התפשטות VSMC תוך קידום התחדשות האנדותל. לכן, יש צורך בו זמנית מחקר התפשטות VSMC ו מחסום אנדותל פונקציה אני vivo .
נכון להיום, יש לנתקמודלים העכבר של restenosis 1 . מודלים אלה כוללים קשירת עורקים ופציעה עורק הירך חוט 2 . מודלים אבי העורקים כוללים מיקום סטנט 3 , פגיעה בלון 4 , ו alortraft אבי העורקים 5 . כל המודלים הנוכחיים מוגבלים. Carutid קשירת מייצר זורם בתיווך neointimal הנגע ואין פגיעה אנדותל. בנוסף, הן עורקי הראש ואת הירך יש הרבה פחות שכבות תאים פחות מאשר כלי אדם, הגבלת הערך translational שלהם. אבי העורקים של העכבר הוא כ 1.3 מ"מ קוטר, הוא כלי שיט רק הקרובה לעורק אנושי קליני (רלוונטי) קלינית (3).
למרות פוטנציאל translational של מודלים אבי העורקים של Murine, מודלים הנוכחי יש מגבלות. מודלים אלה דורשים מיומנויות מתקדמות microsurgical וציוד מיוחדים כגון בלונים אנגיופלסטי ו stents. כאן אנו מציגיםרומן, טכניקה לשחזור בו זמנית לעורר התפשטות VSMC ולשבש את תפקוד מחסום האנדותל.
Protocol
Representative Results
Discussion
יש לנו מאופיין את ההשפעות של מודל פגיעה אבץ Murine שמביא hyperplasia המדיאלי תפקוד לקוי של האנדותל. ניתוק EC חלקי לאורך האינטימה של אבי העורקים מלווה באובדן מגע של תאים סלולריים ושיפור של בליטות התא. במקביל, תפקוד מחסום האנדותל היה לקוי באופן משמעותי, אשר גירוי נתיבי איתות המי?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים Hsia Ru-ching דוקטורט, מן אלקטרונית מיקרוסקופית הליבה מתקן של אוניברסיטת מרילנד בית הספר לרפואה, על התמיכה הטכנית שלה בעיבוד סריקה דגימות מיקרוסקופיה אלקטרונית.
Materials
| Ocular lubricant | Dechra | 17033-211-38 | Pharmaceutical agents |
| Isoflurane | VetOne | 502017 | Pharmaceutical agents |
| Carprofen | Zoetis | 26357 | Pharmaceutical agents |
| Precision vaporizer | Summit Medical | 10675 | Surgical supplies |
| Charcoal scavenger | Bickford Inc. | 80120 | Surgical supplies |
| Isothermal pad | Harvard Apparatus | 50-7053-R | Surgical supplies |
| Sterile cotton-tipped applicator | Fisher Scientific | 23-400-124 | Surgical supplies |
| 4-0 absorbable monofilament suture | Ethicon, Inc | J310 | Surgical supplies |
| 5-0 non-absorbable monofilament suture | Ethicon,Inc | 1666 | Surgical supplies |
| 21-gauge x 1 inch needle | BD Biosciences | 305165 | Surgical supplies |
| 25-gauge x 1 inch needle | BD Biosciences | 305125 | Surgical supplies |
| Dry sterilizer | Cellpoint | 7770 | Surgical supplies |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14058-09 | Surgical instruments |
| Adson forceps | Fine Science Tools | 11006-12 | Surgical instruments |
| Dumont #5 fine forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | Surgical instruments |
| Vannas Spring Scissors 3mm cutting edge | Fine Science Tools | 15000-00 | Surgical instruments |
| Needle driver | Fine Science Tools | 91201-13 | Surgical instruments |
| Scalpel handle #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | Surgical instruments |
| Scalpel blades #10 | Fine Science Tools | 10010-00 | Surgical instruments |
| PBS | Lonza | 17-516F | Reagents for tissue processing |
| Evans Blue | Sigma-Aldrich | E2129 | Reagents for tissue processing |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Reagents for tissue processing |
| Modeling wax | Bego | 40001 | Reagents for tissue processing |
| OCT compound | Tissue-Tek Sakura | 4583 | Reagents for tissue processing |
| Mayer's hematoxylin solution | Sigma-Aldrich | MHS16 | Reagents for immunohistological analysis |
| Eosin Y solution alcoholic | Sigma-Aldrich | HT110316 | Reagents for immunohistological analysis |
| Elastin stain kit | Sigma-Aldrich | HT25A | Reagents for immunohistological analysis |
| Click-it Edu Alexa-488 Imaging Kit | Invitrogen | C10337 | Reagents for immunohistological analysis |
| Anti-Erk1/2 antibody | Cell Signaling Technology | 4695 | Reagents for immunohistological analysis |
| Anti-phospho-Erk1/2 antibody | Cell Signaling Technology | 4370 | Reagents for immunohistological analysis |
| Anti-p27kip1 antibody | Cell Signaling Technology | 3698 | Reagents for immunohistological analysis |
| Trichloroacetic acid | Sigma-Aldrich | T9159 | Reagents for immunohistological analysis |
References
- Carmeliet, P. Mechanisms of angiogenesis and arteriogenesis. Nat Med. 6 (4), 389-395 (2000).
- Carmeliet, P., Moons, L., Collen, D. Mouse models of angiogenesis, arterial stenosis, atherosclerosis and hemostasis. Cardiovasc Res. 39 (1), 8-33 (1998).
- Baker, A. B., et al. Heparanase Alters Arterial Structure, Mechanics, and Repair Following Endovascular Stenting in Mice. Circ Res. 104 (3), 380-387 (2009).
- Petrov, L., Laurila, H., Hayry, P., Vamvakopoulos, J. E. A mouse model of aortic angioplasty for genomic studies of neointimal hyperplasia. J Vasc Res. 42 (4), 292-300 (2005).
- Li, J., et al. Vascular smooth muscle cells of recipient origin mediate intimal expansion after aortic allotransplantation in mice. Am J Path. 158 (6), 1943-1947 (2001).
- Radu, M., Chernoff, J. An in vivo assay to test blood vessel permeability. J Vis Exp. (73), e50062 (2013).
- Turbett, G. R., Sellner, L. N. The use of optimal cutting temperature compound can inhibit amplification by polymerase chain reaction. Diagn Mol Pathol. 6 (5), 298-303 (1997).
- Puchtler, H., Waldrop, F. S. On the mechanism of Verhoeff’s elastica stain: a convenient stain for myelin sheaths. Histochem. 62 (3), 233-247 (1979).
- Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (7), 2415-2420 (2008).
- Nelson, P. R., Yamamura, S., Mureebe, L., Itoh, H., Kent, K. C. Smooth muscle cell migration and proliferation are mediated by distinct phases of activation of the intracellular messenger mitogen-activated protein kinase. J Vasc Surg. 27 (1), 117-125 (1998).
- Rzucidlo, E. M. Signaling pathways regulating vascular smooth muscle cell differentiation. Vascular. 17, S15-S20 (2009).
- Aoki, T., Sumii, T., Mori, T., Wang, X., Lo, E. H. Blood-brain barrier disruption and matrix metalloproteinase-9 expression during reperfusion injury: mechanical versus embolic focal ischemia in spontaneously hypertensive rats. Stroke. 33 (11), 2711-2717 (2002).
- Yu, D., et al. MARCKS Signaling Differentially Regulates Vascular Smooth Muscle and Endothelial Cell Proliferation through a KIS-, p27kip1- Dependent Mechanism. PLoS One. 10 (11), e0141397 (2015).
- Banai, S., et al. Rabbit ear model of injury-induced arterial smooth-muscle cell-proliferation – kinetics, reproducibility, and implications. Circ Res. 69 (3), 748-756 (1991).
