Lesione aortica di crusca a murina: un efficace<em> In Vivo</em> Modello di proliferazione cellulare liscia e funzione endoteliale
Summary
La restenosi dopo procedure cardiovascolari (chirurgia bypass, angioplastica o stenting) è un problema significativo che riduce la durata di queste procedure. Una terapia ideale potrebbe inibire la proliferazione delle cellule muscolari lisce (VSMC), promuovendo la rigenerazione dell'endotelio. Descriviamo un modello per la valutazione simultanea della proliferazione VSMC e della funzione endoteliale in vivo.
Abstract
La ricostruzione arteriosa, sia in caso di angioplastica che di intervento di bypass, comporta traumi iatrogeni che provocano disturbi endoteliali e proliferazione delle cellule muscolari lisce vascolari (VSMC). I modelli murini comuni studiano piccole vasi come le arterie carotide e femorali. Qui descriviamo un sistema in vivo in cui sia la proliferazione VSMC che la funzione di barriera endoteliale possono essere valutate contemporaneamente in un grande recipiente. Abbiamo studiato la risposta aortica infrarenale alla lesione nei topi C57BL / 6. L'aorta è stato ferito dalla vena renale sinistra alla biforcazione aortica da 30 crush transmural di durata di 5 secondi con un applicatore a cotone. I cambiamenti morfologici sono stati valutati con l'istologia convenzionale. Lo spessore della parete aorta è stato misurato dalla superficie luminare all'adventitia. L'integrazione di EdU e la colorazione di contatori con DAPI e l'alpha-actina è stata utilizzata per dimostrare la proliferazione del VSMC. L'attivazione di ERK1 / 2, un moderatore noto della formazione di iperplasia intima, è stato scoraggiatoEstratti da Western Blot. L'effetto dell'infiammazione è stato determinato da immunohistochemistry per le cellule B, le cellule T e macrofagi . Le sezioni di endotelio sono state visualizzate con la microscopia elettronica a scansione (SEM). La funzione di barriera endoteliale è stata determinata con la colorazione Evans Blue. La lesione transmurale ha provocato l'ispessimento della parete aortica. Questa lesione ha causato la proliferazione del VSMC, soprattutto 3 giorni dopo la lesione e l'attivazione precoce di ERK1 / 2 e la diminuzione della espressione p27 kip1. La lesione non ha determinato l'aumento delle cellule B, delle cellule T o dell'infiltrazione dei macrofagi nella parete del vaso. La lesione ha causato denudazione parziale della cellula endoteliale e la perdita del contatto cellulare. La lesione ha causato una significativa perdita di funzione barriera endoteliale, che è tornata alla base dopo sette giorni. Il modello di lesioni aortiche blasfonde trasversali murine fornisce un sistema efficace per studiare contemporaneamente sia la proliferazione VSMC che la funzione di barriera endoteliale in un grande recipiente.
Introduction
La restenosi Seguendo procedure cardiovascolari (chirurgia bypass, angioplastica o stenting) è un problema significativo riducendo la durata di queste procedure. Tutte le procedure di rivascolarizzazione sono afflitte da restenosi. Le strategie presenti per prevenire la restenosi (stent che eluiscono farmaci e palloni rivestiti di droga) inibiscono sia la cellula muscolare liscia vascolare (VSMC) che la proliferazione delle cellule endoteliali (EC). Di conseguenza, questi interventi prevengono la restenosi mediata dal VSMC, ma impediscono anche la rigenerazione dell'endotelio. Senza un endotelio intatto, i pazienti devono essere su potenti agenti antiagglomeranti per ridurre il rischio di trombosi in situ a rischio di complicazioni emorragiche. Una terapia ideale inibirà la proliferazione del VSMC, promuovendo la rigenerazione dell'endotelio. Pertanto, vi è la necessità di studiare simultaneamente la proliferazione VSMC e la funzione di barriera endoteliale i n vivo .
Attualmente, ci sono severModelli di topo restenosi 1 . Questi modelli includono lesioni carotide e lesioni del filo femorale 2 . I modelli aortici includono il posizionamento dello stent 3 , la lesione a palloncino 4 e l'allograft aortico 5 . Tutti i modelli presenti sono limitati. La legatura carotide genera una lesione neointimale mediata dal flusso e non ha lesioni endoteliali. Inoltre, le arterie carotide e femorali hanno molte pieghe meno strati cellulari rispetto ai vasi umani, limitando il loro valore traduzionale. L'aorta del topo, che è di circa 1,3 mm di diametro, è l'unica vaso che si avvicina ad un'arteria umana (coronaria) clinicamente rilevante (3).
Nonostante il potenziale di traslazione dei modelli murali aortici della malattia, i modelli correnti hanno limitazioni. Questi modelli richiedono abilità microchirurgiche avanzate e attrezzature specializzate come palloncini e stents per angioplastica. Qui, noi presentiamoUna nuova tecnica riproducibile per indurre contemporaneamente la proliferazione del VSMC e disturbare la funzione di barriera endoteliale.
Protocol
Representative Results
Discussion
Abbiamo caratterizzato gli effetti di un modello di lesioni aortiche murine che provoca l'iperplasia mediale e la disfunzione della barriera endoteliale. Il distacco parziale CE lungo l'aorta intima ha accompagnato la perdita di contatto cellulare e miglioramento delle protuberanze delle cellule. Corrispondentemente, la funzione di barriera endoteliale è stata significativamente compromessa, che ha stimolato i percorsi di segnalazione sensibili al mitogeno, portando alla proliferazione di VSMC e ad ispessimento…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Ph.D. Hsia Ru-ching, presso l'Electron Microscopy Core Facility della University of Maryland School of Medicine per il suo supporto tecnico nel trattamento dei campioni di scansione microscopica elettronica.
Materials
| Ocular lubricant | Dechra | 17033-211-38 | Pharmaceutical agents |
| Isoflurane | VetOne | 502017 | Pharmaceutical agents |
| Carprofen | Zoetis | 26357 | Pharmaceutical agents |
| Precision vaporizer | Summit Medical | 10675 | Surgical supplies |
| Charcoal scavenger | Bickford Inc. | 80120 | Surgical supplies |
| Isothermal pad | Harvard Apparatus | 50-7053-R | Surgical supplies |
| Sterile cotton-tipped applicator | Fisher Scientific | 23-400-124 | Surgical supplies |
| 4-0 absorbable monofilament suture | Ethicon, Inc | J310 | Surgical supplies |
| 5-0 non-absorbable monofilament suture | Ethicon,Inc | 1666 | Surgical supplies |
| 21-gauge x 1 inch needle | BD Biosciences | 305165 | Surgical supplies |
| 25-gauge x 1 inch needle | BD Biosciences | 305125 | Surgical supplies |
| Dry sterilizer | Cellpoint | 7770 | Surgical supplies |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14058-09 | Surgical instruments |
| Adson forceps | Fine Science Tools | 11006-12 | Surgical instruments |
| Dumont #5 fine forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | Surgical instruments |
| Vannas Spring Scissors 3mm cutting edge | Fine Science Tools | 15000-00 | Surgical instruments |
| Needle driver | Fine Science Tools | 91201-13 | Surgical instruments |
| Scalpel handle #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | Surgical instruments |
| Scalpel blades #10 | Fine Science Tools | 10010-00 | Surgical instruments |
| PBS | Lonza | 17-516F | Reagents for tissue processing |
| Evans Blue | Sigma-Aldrich | E2129 | Reagents for tissue processing |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Reagents for tissue processing |
| Modeling wax | Bego | 40001 | Reagents for tissue processing |
| OCT compound | Tissue-Tek Sakura | 4583 | Reagents for tissue processing |
| Mayer's hematoxylin solution | Sigma-Aldrich | MHS16 | Reagents for immunohistological analysis |
| Eosin Y solution alcoholic | Sigma-Aldrich | HT110316 | Reagents for immunohistological analysis |
| Elastin stain kit | Sigma-Aldrich | HT25A | Reagents for immunohistological analysis |
| Click-it Edu Alexa-488 Imaging Kit | Invitrogen | C10337 | Reagents for immunohistological analysis |
| Anti-Erk1/2 antibody | Cell Signaling Technology | 4695 | Reagents for immunohistological analysis |
| Anti-phospho-Erk1/2 antibody | Cell Signaling Technology | 4370 | Reagents for immunohistological analysis |
| Anti-p27kip1 antibody | Cell Signaling Technology | 3698 | Reagents for immunohistological analysis |
| Trichloroacetic acid | Sigma-Aldrich | T9159 | Reagents for immunohistological analysis |
References
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