Murine Aortic Crush Skade: En Effektiv<em> In vivo</em> Modell av jevn spredning av muskelceller og endotelfunksjon
Summary
Restenose etter kardiovaskulære prosedyrer (bypass kirurgi, angioplastikk eller stenting) er et betydelig problem som reduserer holdbarheten av disse prosedyrene. En ideell terapi vil hemme proliferasjon av glatt muskelcelle mens den fremmer regenerering av endotelet. Vi beskriver en modell for samtidig vurdering av VSMC proliferasjon og endotelfunksjon in vivo.
Abstract
Arteriell rekonstruksjon, enten angioplastikk eller bypass-kirurgi, involverer iatrogen trauma som forårsaker endotelavbrudd og vascular glatt muskelcelle (VSMC) proliferasjon. Vanlige murine modeller studerer små fartøy som karoten og femorale arterier. Her beskriver vi et in vivo system hvor både VSMC proliferasjon og endotelbarrierefunksjonen kan vurderes samtidig i en stor beholder. Vi studerte infrarenal aorta respons på skade i C57BL / 6 mus. Aorta ble skadet fra venstre renalvein til aorta-bifurkasjon med 30 transmurale knusninger med 5 sekunder lang varighet med en bomullstipsapplikator. Morfologiske endringer ble vurdert med konvensjonell histologi. Aorta-veggtykkelsen ble målt fra luminalflaten til adventitia. EdU-integrasjon og tellerfarvning med DAPI og alpha-actin ble brukt til å demonstrere VSMC-proliferasjon. Aktivering av ERK1 / 2, en kjent moderator for intimal hyperplasi-dannelse, ble avskrekketUtvunnet av Western Blot-analyse. Effekten av betennelse ble bestemt ved immunhistokjemi for B-celler, T-celler og makrofager . En ansiktsseksjoner av endotelet ble visualisert med skanningelektronmikroskopi (SEM). Endotelbarrierefunksjonen ble bestemt med Evans Blue-farging. Transmural skade resulterte i aorta veggtykkelse. Denne skaden induserte VSMC proliferasjon, mest fremtredende ved 3 dager etter skade, og tidlig aktivering av ERK1 / 2 og redusert p27 kip1 ekspression. Skade resulterte ikke i økte B-celler, T-celler eller makrofager infiltrering i kargen veggen. Skade forårsaket delvis endotelcelle denudasjon og tap av cellecellekontakt. Skade resulterte i et signifikant tap av endotelbarrierefunksjonen, som returnerte til baseline etter syv dager. Den murine transmurale slanke aorta-skademodellen gir et effektivt system for samtidig å studere både VSMC-proliferasjon og endotelbarrierefunksjon i en stor beholder.
Introduction
restenose Følgende kardiovaskulære prosedyrer (bypass kirurgi, angioplastikk eller stenting) er et betydelig problem som reduserer holdbarheten av disse prosedyrene. Alle revaskulariseringsprosedyrer plages av restenose. Nåværende strategier for å hindre restenose (legemiddeleluerende stenter og medikamentbelagte ballonger) hemmer både vaskulær glattmuskelcelle (VSMC) og endotelcelleproliferasjon (EC). Følgelig forhindrer disse intervensjonene VSMC-mediert restose, men forhindrer også regenerering av endotelet. Uten intakt endotel skal pasienter være på potente antiplatelet midler for å redusere risikoen for in situ trombose med risiko for blødningskomplikasjoner. En ideell terapi vil hemme VSMC-proliferasjon samtidig som det fremmer regenerering av endotelet. Dermed er det et behov for samtidig å studere VSMC proliferasjon og endotelbarrierefunksjon i n vivo .
For tiden er det alvorligAl musemodeller av restenose 1 . Disse modellene inkluderer carotidligasjon og femoralt arterie ledningsskade 2 . Aorta modeller inkluderer stent plassering 3 , ballong skade 4 og aorta allograft 5 . Alle de nåværende modellene er begrenset. Carotidligering genererer en strømningsmediert neointimal lesjon og har ikke endotelskader. I tillegg har begge karotid- og femorale arterier mange ganger færre cellelag enn menneskeskap, og begrenser deres translasjonsverdi. Musaortaen som er ca. 1,3 mm i diameter, er det eneste fartøyet som tilnærmer seg en klinisk relevant (kransartet) menneskearterie (3).
Til tross for det translasjonelle potensialet for muse-aorta-modeller av sykdom, har nåværende modeller begrensninger. Disse modellene krever avanserte mikrokirurgiske ferdigheter og spesialisert utstyr som angioplastikkballonger og stenter. Her presenterer viEn roman, reproduserbar teknikk for samtidig å indusere VSMC proliferasjon og forstyrre endotelbarrierefunksjonen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi har karakterisert effekten av en muse-aortisk skade modell som resulterer i medial hyperplasi og endotel barriere dysfunksjon. Delvis EC-frigjøring langs aorta-intima ledsaget av tap av cellecellekontakt og forbedring av cellefremspring. Tilsvarende var endotelbarrierefunksjonen signifikant svekket, noe som stimulerte de mitogenfølsomme signalveiene, noe som førte til proliferasjon av VSMC og fortykkelse av karvegveggen. Styrken i denne modellen er at det er teknisk lettere å lære og utføre enn andre aorta-mode…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Hsia Ru-ching PhD, fra Electron Microscopy Core Facility ved University of Maryland School of Medicine, for hennes tekniske støtte i behandlingen av scannings elektroniske mikroskopi prøver.
Materials
| Ocular lubricant | Dechra | 17033-211-38 | Pharmaceutical agents |
| Isoflurane | VetOne | 502017 | Pharmaceutical agents |
| Carprofen | Zoetis | 26357 | Pharmaceutical agents |
| Precision vaporizer | Summit Medical | 10675 | Surgical supplies |
| Charcoal scavenger | Bickford Inc. | 80120 | Surgical supplies |
| Isothermal pad | Harvard Apparatus | 50-7053-R | Surgical supplies |
| Sterile cotton-tipped applicator | Fisher Scientific | 23-400-124 | Surgical supplies |
| 4-0 absorbable monofilament suture | Ethicon, Inc | J310 | Surgical supplies |
| 5-0 non-absorbable monofilament suture | Ethicon,Inc | 1666 | Surgical supplies |
| 21-gauge x 1 inch needle | BD Biosciences | 305165 | Surgical supplies |
| 25-gauge x 1 inch needle | BD Biosciences | 305125 | Surgical supplies |
| Dry sterilizer | Cellpoint | 7770 | Surgical supplies |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14058-09 | Surgical instruments |
| Adson forceps | Fine Science Tools | 11006-12 | Surgical instruments |
| Dumont #5 fine forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | Surgical instruments |
| Vannas Spring Scissors 3mm cutting edge | Fine Science Tools | 15000-00 | Surgical instruments |
| Needle driver | Fine Science Tools | 91201-13 | Surgical instruments |
| Scalpel handle #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | Surgical instruments |
| Scalpel blades #10 | Fine Science Tools | 10010-00 | Surgical instruments |
| PBS | Lonza | 17-516F | Reagents for tissue processing |
| Evans Blue | Sigma-Aldrich | E2129 | Reagents for tissue processing |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Reagents for tissue processing |
| Modeling wax | Bego | 40001 | Reagents for tissue processing |
| OCT compound | Tissue-Tek Sakura | 4583 | Reagents for tissue processing |
| Mayer's hematoxylin solution | Sigma-Aldrich | MHS16 | Reagents for immunohistological analysis |
| Eosin Y solution alcoholic | Sigma-Aldrich | HT110316 | Reagents for immunohistological analysis |
| Elastin stain kit | Sigma-Aldrich | HT25A | Reagents for immunohistological analysis |
| Click-it Edu Alexa-488 Imaging Kit | Invitrogen | C10337 | Reagents for immunohistological analysis |
| Anti-Erk1/2 antibody | Cell Signaling Technology | 4695 | Reagents for immunohistological analysis |
| Anti-phospho-Erk1/2 antibody | Cell Signaling Technology | 4370 | Reagents for immunohistological analysis |
| Anti-p27kip1 antibody | Cell Signaling Technology | 3698 | Reagents for immunohistological analysis |
| Trichloroacetic acid | Sigma-Aldrich | T9159 | Reagents for immunohistological analysis |
References
- Carmeliet, P. Mechanisms of angiogenesis and arteriogenesis. Nat Med. 6 (4), 389-395 (2000).
- Carmeliet, P., Moons, L., Collen, D. Mouse models of angiogenesis, arterial stenosis, atherosclerosis and hemostasis. Cardiovasc Res. 39 (1), 8-33 (1998).
- Baker, A. B., et al. Heparanase Alters Arterial Structure, Mechanics, and Repair Following Endovascular Stenting in Mice. Circ Res. 104 (3), 380-387 (2009).
- Petrov, L., Laurila, H., Hayry, P., Vamvakopoulos, J. E. A mouse model of aortic angioplasty for genomic studies of neointimal hyperplasia. J Vasc Res. 42 (4), 292-300 (2005).
- Li, J., et al. Vascular smooth muscle cells of recipient origin mediate intimal expansion after aortic allotransplantation in mice. Am J Path. 158 (6), 1943-1947 (2001).
- Radu, M., Chernoff, J. An in vivo assay to test blood vessel permeability. J Vis Exp. (73), e50062 (2013).
- Turbett, G. R., Sellner, L. N. The use of optimal cutting temperature compound can inhibit amplification by polymerase chain reaction. Diagn Mol Pathol. 6 (5), 298-303 (1997).
- Puchtler, H., Waldrop, F. S. On the mechanism of Verhoeff’s elastica stain: a convenient stain for myelin sheaths. Histochem. 62 (3), 233-247 (1979).
- Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (7), 2415-2420 (2008).
- Nelson, P. R., Yamamura, S., Mureebe, L., Itoh, H., Kent, K. C. Smooth muscle cell migration and proliferation are mediated by distinct phases of activation of the intracellular messenger mitogen-activated protein kinase. J Vasc Surg. 27 (1), 117-125 (1998).
- Rzucidlo, E. M. Signaling pathways regulating vascular smooth muscle cell differentiation. Vascular. 17, S15-S20 (2009).
- Aoki, T., Sumii, T., Mori, T., Wang, X., Lo, E. H. Blood-brain barrier disruption and matrix metalloproteinase-9 expression during reperfusion injury: mechanical versus embolic focal ischemia in spontaneously hypertensive rats. Stroke. 33 (11), 2711-2717 (2002).
- Yu, D., et al. MARCKS Signaling Differentially Regulates Vascular Smooth Muscle and Endothelial Cell Proliferation through a KIS-, p27kip1- Dependent Mechanism. PLoS One. 10 (11), e0141397 (2015).
- Banai, S., et al. Rabbit ear model of injury-induced arterial smooth-muscle cell-proliferation – kinetics, reproducibility, and implications. Circ Res. 69 (3), 748-756 (1991).
