Повреждение дрожь в аритмии: эффективный<em> В Виво</em> Модель гладкой мышечной клеточной пролиферации и эндотелиальной функции
Summary
Рестеноз после сердечно-сосудистых процедур (шунтирование, ангиопластика или стентирование) является значительной проблемой, снижающей долговечность этих процедур. Идеальная терапия ингибирует пролиферацию гладких мышечных клеток (VSMC), способствуя регенерации эндотелия. Мы описываем модель одновременной оценки пролиферации VSMC и эндотелиальной функции in vivo.
Abstract
Артериальная реконструкция, будь то ангиопластика или шунтирование, связана с ятрогенной травмой, вызывающей нарушение эндотелия и пролиферацию гладких мышц сосудов (VSMC). Обычные мышиные модели исследуют небольшие сосуды, такие как сонные и бедренные артерии. Здесь мы описываем систему in vivo , в которой как VSMC-пролиферацию, так и функцию эндотелиального барьера можно одновременно оценить в большом сосуде. Мы изучили реакцию инфарренальной аорты на повреждение у мышей C57BL / 6. Аорта была повреждена от левой почечной вены до бифуркации аорты на 30 трансмуральных давлений продолжительностью 5 секунд с помощью аппликатора с хлопковым наконечником. Морфологические изменения оценивали с помощью обычной гистологии. Толщина стенки аорты измерялась от поверхности просвета до адвентиции. Для демонстрации VSMC-пролиферации использовали интеграцию ЭДУ и противодействующее окрашивание с помощью DAPI и альфа-актина. Активация ERK1 / 2, известного замедлителя формирования гиперплазии интимы, сдерживаласьПроведенный Вестерн-блот-анализом. Эффект воспаления определяли иммуногистохимией для В-клеток, Т-клеток и макрофагов . На участках эндотелия были выделены сканирующая электронная микроскопия (СЭМ). Эндотелиальную барьерную функцию определяли окрашиванием Evans Blue. Трансмуральная травма привела к утолщению стенки аорты. Эта рана индуцировала пролиферацию VSMC, наиболее заметно через 3 дня после травмы и раннюю активацию ERK1 / 2 и снижение экспрессии p27 kip1. Травма не приводила к увеличению В-клеток, Т-клеток или инфильтрации макрофагов в стенке сосуда. Травма вызвала частичную денудацию эндотелиальных клеток и потерю контакта клеток. Травма привела к значительной потере функции эндотелиального барьера, которая вернулась к исходному состоянию через семь дней. Модель трансмуральной тупой аортальной модели мыши обеспечивает эффективную систему для одновременного изучения как пролиферации VSMC, так и функции эндотелия в большом сосуде.
Introduction
рестеноз Следующие сердечно-сосудистые процедуры (обходная хирургия, ангиопластика или стентирование) являются значительной проблемой, снижающей долговечность этих процедур. Все процедуры реваскуляризации страдают рестенозом. Существующие стратегии профилактики рестеноза (стенты с лекарственным покрытием и покрытые лекарством шары) ингибируют как сосудистую гладкомышечную клетку (VSMC), так и пролиферацию эндотелиальных клеток (EC). Следовательно, эти вмешательства предотвращают опосредуемый VSMC рестеноз, но также предотвращают регенерацию эндотелия. Без интактного эндотелия пациенты должны находиться на мощных антиагрегантных средствах, чтобы снизить риск тромбоза in situ при риске осложнений кровотечения. Идеальная терапия будет ингибировать пролиферацию VSMC, способствуя регенерации эндотелия. Таким образом, необходимо одновременно изучать пролиферацию VSMC и функцию эндотелиального барьера i n vivo .
В настоящее время естьМышиные модели рестеноза 1 . Эти модели включают каротидную лигирование и повреждение проволоки бедренной артерии 2 . Модели аорты включают размещение стента 3 , повреждение 4 баллонов и аллотрансплантат аорты 5 . Все существующие модели ограничены. Перевязка сонной артерии генерирует опосредованное потоком неоинтимальное поражение и не имеет эндотелиального повреждения. Кроме того, обе сонные и бедренные артерии имеют в несколько раз меньше клеточных слоев, чем сосуды для человека, что ограничивает их поступательное значение. Аорта мыши диаметром около 1,3 мм является единственным сосудом, который аппроксимирует клинически значимую (коронарную) человеческую артерию (3).
Несмотря на поступательный потенциал мышиных аортальных моделей болезни, существующие модели имеют ограничения. Эти модели требуют передовых микрохирургических навыков и специализированного оборудования, такого как аэропланы и стенты ангиопластики. Здесь мы представляемНовый, воспроизводимый метод, чтобы одновременно индуцировать пролиферацию VSMC и нарушать функцию эндотелиального барьера.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы охарактеризовали влияние модели повреждения мышиной аорты, которая приводит к медиальной гиперплазии и дисфункции эндотелиальных барьеров. Частичное отделение EC вдоль аорты интимы сопровождалось потерей клеточного клеточного контакта и усилением клеточных выступов. Соответств?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим докторскую степень Hsia Ru-ching от Главной основы электронной микроскопии Школы медицины Университета Мэриленда за ее техническую поддержку в обработке образцов сканирующей электронной микроскопии.
Materials
| Ocular lubricant | Dechra | 17033-211-38 | Pharmaceutical agents |
| Isoflurane | VetOne | 502017 | Pharmaceutical agents |
| Carprofen | Zoetis | 26357 | Pharmaceutical agents |
| Precision vaporizer | Summit Medical | 10675 | Surgical supplies |
| Charcoal scavenger | Bickford Inc. | 80120 | Surgical supplies |
| Isothermal pad | Harvard Apparatus | 50-7053-R | Surgical supplies |
| Sterile cotton-tipped applicator | Fisher Scientific | 23-400-124 | Surgical supplies |
| 4-0 absorbable monofilament suture | Ethicon, Inc | J310 | Surgical supplies |
| 5-0 non-absorbable monofilament suture | Ethicon,Inc | 1666 | Surgical supplies |
| 21-gauge x 1 inch needle | BD Biosciences | 305165 | Surgical supplies |
| 25-gauge x 1 inch needle | BD Biosciences | 305125 | Surgical supplies |
| Dry sterilizer | Cellpoint | 7770 | Surgical supplies |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14058-09 | Surgical instruments |
| Adson forceps | Fine Science Tools | 11006-12 | Surgical instruments |
| Dumont #5 fine forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | Surgical instruments |
| Vannas Spring Scissors 3mm cutting edge | Fine Science Tools | 15000-00 | Surgical instruments |
| Needle driver | Fine Science Tools | 91201-13 | Surgical instruments |
| Scalpel handle #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | Surgical instruments |
| Scalpel blades #10 | Fine Science Tools | 10010-00 | Surgical instruments |
| PBS | Lonza | 17-516F | Reagents for tissue processing |
| Evans Blue | Sigma-Aldrich | E2129 | Reagents for tissue processing |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Reagents for tissue processing |
| Modeling wax | Bego | 40001 | Reagents for tissue processing |
| OCT compound | Tissue-Tek Sakura | 4583 | Reagents for tissue processing |
| Mayer's hematoxylin solution | Sigma-Aldrich | MHS16 | Reagents for immunohistological analysis |
| Eosin Y solution alcoholic | Sigma-Aldrich | HT110316 | Reagents for immunohistological analysis |
| Elastin stain kit | Sigma-Aldrich | HT25A | Reagents for immunohistological analysis |
| Click-it Edu Alexa-488 Imaging Kit | Invitrogen | C10337 | Reagents for immunohistological analysis |
| Anti-Erk1/2 antibody | Cell Signaling Technology | 4695 | Reagents for immunohistological analysis |
| Anti-phospho-Erk1/2 antibody | Cell Signaling Technology | 4370 | Reagents for immunohistological analysis |
| Anti-p27kip1 antibody | Cell Signaling Technology | 3698 | Reagents for immunohistological analysis |
| Trichloroacetic acid | Sigma-Aldrich | T9159 | Reagents for immunohistological analysis |
References
- Carmeliet, P. Mechanisms of angiogenesis and arteriogenesis. Nat Med. 6 (4), 389-395 (2000).
- Carmeliet, P., Moons, L., Collen, D. Mouse models of angiogenesis, arterial stenosis, atherosclerosis and hemostasis. Cardiovasc Res. 39 (1), 8-33 (1998).
- Baker, A. B., et al. Heparanase Alters Arterial Structure, Mechanics, and Repair Following Endovascular Stenting in Mice. Circ Res. 104 (3), 380-387 (2009).
- Petrov, L., Laurila, H., Hayry, P., Vamvakopoulos, J. E. A mouse model of aortic angioplasty for genomic studies of neointimal hyperplasia. J Vasc Res. 42 (4), 292-300 (2005).
- Li, J., et al. Vascular smooth muscle cells of recipient origin mediate intimal expansion after aortic allotransplantation in mice. Am J Path. 158 (6), 1943-1947 (2001).
- Radu, M., Chernoff, J. An in vivo assay to test blood vessel permeability. J Vis Exp. (73), e50062 (2013).
- Turbett, G. R., Sellner, L. N. The use of optimal cutting temperature compound can inhibit amplification by polymerase chain reaction. Diagn Mol Pathol. 6 (5), 298-303 (1997).
- Puchtler, H., Waldrop, F. S. On the mechanism of Verhoeff’s elastica stain: a convenient stain for myelin sheaths. Histochem. 62 (3), 233-247 (1979).
- Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (7), 2415-2420 (2008).
- Nelson, P. R., Yamamura, S., Mureebe, L., Itoh, H., Kent, K. C. Smooth muscle cell migration and proliferation are mediated by distinct phases of activation of the intracellular messenger mitogen-activated protein kinase. J Vasc Surg. 27 (1), 117-125 (1998).
- Rzucidlo, E. M. Signaling pathways regulating vascular smooth muscle cell differentiation. Vascular. 17, S15-S20 (2009).
- Aoki, T., Sumii, T., Mori, T., Wang, X., Lo, E. H. Blood-brain barrier disruption and matrix metalloproteinase-9 expression during reperfusion injury: mechanical versus embolic focal ischemia in spontaneously hypertensive rats. Stroke. 33 (11), 2711-2717 (2002).
- Yu, D., et al. MARCKS Signaling Differentially Regulates Vascular Smooth Muscle and Endothelial Cell Proliferation through a KIS-, p27kip1- Dependent Mechanism. PLoS One. 10 (11), e0141397 (2015).
- Banai, S., et al. Rabbit ear model of injury-induced arterial smooth-muscle cell-proliferation – kinetics, reproducibility, and implications. Circ Res. 69 (3), 748-756 (1991).
