Murine Aortic Crush Skada: En Effektiv<em> In vivo</em> Modell för smidig muskelcellspridning och endotelfunktion
Summary
Restenos efter kardiovaskulära förfaranden (bypassoperation, angioplastik eller stenting) är ett signifikant problem som minskar hållbarheten hos dessa förfaranden. En ideell terapi skulle inhibera proliferation av glattmuskelcell (VSMC) och samtidigt främja regenerering av endotelet. Vi beskriver en modell för samtidig utvärdering av VSMC proliferation och endotelfunktion in vivo.
Abstract
Arteriell återuppbyggnad, oavsett angioplastik eller bypass-kirurgi, involverar iatrogena trauma som orsakar endotelavbrott och proliferation av vaskulär glattmuskelcell. Vanliga murinmodeller studerar små kärl som carotid och femorala artärer. Här beskrivs ett in vivo- system där både VSMC-proliferation och endotelbarriärfunktion kan utvärderas samtidigt i ett stort kärl. Vi studerade infrarenal aorta respons mot skada hos C57BL / 6 möss. Aortan skadades från den vänstra renala venen till aorta-bifurcationen med 30 transmurala krossar om 5 sekunder lång varaktighet med en bomullstipsapplikator. Morfologiska förändringar bedömdes med konventionell histologi. Aorta-väggtjockleken mättes från luminalytan till adventitia. EdU-integration och motfärgning med DAPI och alfa-aktin användes för att demonstrera VSMC-proliferation. Aktivering av ERK1 / 2, en känd moderator av intimal hyperplasi-bildning, avskräcktesMinas genom Western Blot-analys. Effekten av inflammation bestämdes genom immunhistokemi för B-celler, T-celler och makrofager . En ansiktssektioner av endotelet visualiserades med scanningelektronmikroskopi (SEM). Endotelbarriärfunktionen bestämdes med Evans Blue-färgning. Transmural skada resulterade i aortaväggsförtjockning. Denna skada inducerade VSMC proliferation, mest framträdande vid 3 dagar efter skada, och tidig aktivering av ERK1 / 2 och minskat p27 kip1 uttryck. Skada resulterade inte i ökad infektion av B-celler, T-celler eller makrofager i kärlväggen. Skada orsakade partiell endotelcell-denudation och förlust av cellcellskontakt. Skada resulterade i en signifikant förlust av endotelbarriärfunktionen, som återvände till baslinjen efter sju dagar. Den murina transmurala trubbiga aorta skademodellen ger ett effektivt system för att samtidigt studera både VSMC-proliferation och endotelbarriärfunktion i ett stort kärl.
Introduction
restenos Följande kardiovaskulära förfaranden (bypassoperation, angioplastik eller stentning) är ett signifikant problem som minskar hållbarheten hos dessa förfaranden. Alla revaskulariseringsprocedurer plågas av restenos. Nuvarande strategier för att förhindra restenos (läkemedelseluerende stenter och läkemedelsbelagda ballonger) inhiberar både vaskulär glattmuskelcell (VSMC) och endotelcellerproliferation (EC). Följaktligen förhindrar dessa ingrepp VSMC-medierad restenos, men förhindrar också regenerering av endotelet. Utan ett intakt endotel behövs patienter på potenta antiplatelet medel för att minska risken för in situ trombos med risk för blödningskomplikationer. En ideell terapi skulle inhibera VSMC-proliferation samtidigt som man främjar regenerering av endotelet. Det finns således ett behov av att samtidigt studera VSMC-proliferation och endotelbarriärfunktion i n vivo .
För närvarande är det svårtAl musmodeller av restenos 1 . Dessa modeller inkluderar karotidligering och femoral artär ledningsskada 2 . Aorta modeller inkluderar stent placering 3 , ballong skada 4 och aorta allograft 5 . Samtliga nuvarande modeller är begränsade. Carotidligering genererar en flödesmedierad neointimal lesion och har inte endotelskada. Dessutom har både karotid- och femorala artärer många gånger färre cellskikt än humana kärl, vilket begränsar deras translationsvärde. Mus aorta som är ca 1,3 mm i diameter, är det enda kärlet som approximerar en kliniskt relevant (kranskärl) mänsklig artär (3).
Trots den translatoriska potentialen hos murina aorta-modeller av sjukdom har nuvarande modeller begränsningar. Dessa modeller kräver avancerade mikrokirurgiska färdigheter och specialiserad utrustning som angioplastikballonger och stenter. Här presenterar viEn ny reproducerbar teknik för att samtidigt inducera VSMC-proliferation och störa endotelbarriärfunktionen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi har karaktäriserat effekterna av en murin aorta skademodell som resulterar i medial hyperplasi och endotelbarriär dysfunktion. Delvis EC-avlägsnande längs aorta intima åtföljde förlusten av cellcellskontakt och förbättring av cellutsprång. På motsvarande sätt försämrades endotelbarriärfunktionen, som stimulerade de mitogenkänsliga signaleringsvägarna, vilket ledde till proliferation av VSMC och förtjockning av kärlväggen. Styrkan i denna modell är att det är tekniskt lättare att lära sig och u…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Hsia Ru-ching PhD, från Electron Microscopy Core Facility vid University of Maryland School of Medicine, för hennes tekniska support vid behandling av scanning elektroniska mikroskopi prover.
Materials
| Ocular lubricant | Dechra | 17033-211-38 | Pharmaceutical agents |
| Isoflurane | VetOne | 502017 | Pharmaceutical agents |
| Carprofen | Zoetis | 26357 | Pharmaceutical agents |
| Precision vaporizer | Summit Medical | 10675 | Surgical supplies |
| Charcoal scavenger | Bickford Inc. | 80120 | Surgical supplies |
| Isothermal pad | Harvard Apparatus | 50-7053-R | Surgical supplies |
| Sterile cotton-tipped applicator | Fisher Scientific | 23-400-124 | Surgical supplies |
| 4-0 absorbable monofilament suture | Ethicon, Inc | J310 | Surgical supplies |
| 5-0 non-absorbable monofilament suture | Ethicon,Inc | 1666 | Surgical supplies |
| 21-gauge x 1 inch needle | BD Biosciences | 305165 | Surgical supplies |
| 25-gauge x 1 inch needle | BD Biosciences | 305125 | Surgical supplies |
| Dry sterilizer | Cellpoint | 7770 | Surgical supplies |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14058-09 | Surgical instruments |
| Adson forceps | Fine Science Tools | 11006-12 | Surgical instruments |
| Dumont #5 fine forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | Surgical instruments |
| Vannas Spring Scissors 3mm cutting edge | Fine Science Tools | 15000-00 | Surgical instruments |
| Needle driver | Fine Science Tools | 91201-13 | Surgical instruments |
| Scalpel handle #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | Surgical instruments |
| Scalpel blades #10 | Fine Science Tools | 10010-00 | Surgical instruments |
| PBS | Lonza | 17-516F | Reagents for tissue processing |
| Evans Blue | Sigma-Aldrich | E2129 | Reagents for tissue processing |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Reagents for tissue processing |
| Modeling wax | Bego | 40001 | Reagents for tissue processing |
| OCT compound | Tissue-Tek Sakura | 4583 | Reagents for tissue processing |
| Mayer's hematoxylin solution | Sigma-Aldrich | MHS16 | Reagents for immunohistological analysis |
| Eosin Y solution alcoholic | Sigma-Aldrich | HT110316 | Reagents for immunohistological analysis |
| Elastin stain kit | Sigma-Aldrich | HT25A | Reagents for immunohistological analysis |
| Click-it Edu Alexa-488 Imaging Kit | Invitrogen | C10337 | Reagents for immunohistological analysis |
| Anti-Erk1/2 antibody | Cell Signaling Technology | 4695 | Reagents for immunohistological analysis |
| Anti-phospho-Erk1/2 antibody | Cell Signaling Technology | 4370 | Reagents for immunohistological analysis |
| Anti-p27kip1 antibody | Cell Signaling Technology | 3698 | Reagents for immunohistological analysis |
| Trichloroacetic acid | Sigma-Aldrich | T9159 | Reagents for immunohistological analysis |
References
- Carmeliet, P. Mechanisms of angiogenesis and arteriogenesis. Nat Med. 6 (4), 389-395 (2000).
- Carmeliet, P., Moons, L., Collen, D. Mouse models of angiogenesis, arterial stenosis, atherosclerosis and hemostasis. Cardiovasc Res. 39 (1), 8-33 (1998).
- Baker, A. B., et al. Heparanase Alters Arterial Structure, Mechanics, and Repair Following Endovascular Stenting in Mice. Circ Res. 104 (3), 380-387 (2009).
- Petrov, L., Laurila, H., Hayry, P., Vamvakopoulos, J. E. A mouse model of aortic angioplasty for genomic studies of neointimal hyperplasia. J Vasc Res. 42 (4), 292-300 (2005).
- Li, J., et al. Vascular smooth muscle cells of recipient origin mediate intimal expansion after aortic allotransplantation in mice. Am J Path. 158 (6), 1943-1947 (2001).
- Radu, M., Chernoff, J. An in vivo assay to test blood vessel permeability. J Vis Exp. (73), e50062 (2013).
- Turbett, G. R., Sellner, L. N. The use of optimal cutting temperature compound can inhibit amplification by polymerase chain reaction. Diagn Mol Pathol. 6 (5), 298-303 (1997).
- Puchtler, H., Waldrop, F. S. On the mechanism of Verhoeff’s elastica stain: a convenient stain for myelin sheaths. Histochem. 62 (3), 233-247 (1979).
- Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (7), 2415-2420 (2008).
- Nelson, P. R., Yamamura, S., Mureebe, L., Itoh, H., Kent, K. C. Smooth muscle cell migration and proliferation are mediated by distinct phases of activation of the intracellular messenger mitogen-activated protein kinase. J Vasc Surg. 27 (1), 117-125 (1998).
- Rzucidlo, E. M. Signaling pathways regulating vascular smooth muscle cell differentiation. Vascular. 17, S15-S20 (2009).
- Aoki, T., Sumii, T., Mori, T., Wang, X., Lo, E. H. Blood-brain barrier disruption and matrix metalloproteinase-9 expression during reperfusion injury: mechanical versus embolic focal ischemia in spontaneously hypertensive rats. Stroke. 33 (11), 2711-2717 (2002).
- Yu, D., et al. MARCKS Signaling Differentially Regulates Vascular Smooth Muscle and Endothelial Cell Proliferation through a KIS-, p27kip1- Dependent Mechanism. PLoS One. 10 (11), e0141397 (2015).
- Banai, S., et al. Rabbit ear model of injury-induced arterial smooth-muscle cell-proliferation – kinetics, reproducibility, and implications. Circ Res. 69 (3), 748-756 (1991).
