Swab Sampling Methode voor de detectie van humane Norovirus op oppervlakken

Summary

A macrofoam based sampling methodology was developed and evaluated for the detection and quantification of norovirus on environmental hard surfaces.

Abstract

Human noroviruses zijn een belangrijke oorzaak van de epidemie en sporadische gastro-enteritis wereldwijd. Omdat de meeste infecties, hetzij rechtstreeks worden verspreid via de route van persoon tot persoon of indirect via het milieu oppervlakken of voedsel, besmet fomites en levenloze oppervlakken zijn belangrijke voertuigen voor de verspreiding van het virus tijdens het norovirus uitbraken.

We ontwikkeld en geëvalueerd een protocol met behulp van macroschuim swabs voor de detectie en typering van de menselijke norovirussen van harde oppervlakken. Vergeleken met vezel getipte swabs of antistatische doekjes, macroschuim swabs toestaan virus herstel (range 1,2-33,6%) van de wc-bril oppervlakken van maximaal 700 cm ^2. Het protocol omvat stappen voor de extractie van het virus van de swabs en verdere concentratie van het virale RNA met behulp spinkolommen. In totaal zijn 127 (58,5%) van de 217 wattenstaafje monsters die waren verzameld van oppervlakken in cruiseschepen en langdurige zorg voorzieningen waar norovirus gastro-enteritis was geweestgerapporteerd testte positief voor GII norovirus door RT-qPCR. Van deze 29 (22,8%) met succes kon worden gegenotypeerd. Tot slot, detectie van norovirus op het milieu oppervlakken met behulp van het protocol ontwikkelden we kunnen helpen bij het bepalen van het niveau van milieuverontreiniging tijdens uitbraken alsmede opsporing van het virus wanneer klinische monsters niet beschikbaar zijn; het kan ook het toezicht op de effectiviteit van de sanering strategieën te vergemakkelijken.

Introduction

Human noroviruses zijn een belangrijke oorzaak van de epidemie en sporadische acute gastro-enteritis wereldwijd ^{1, 2, 3.} Het virus is zeer besmettelijk en de transmissie gebeurt via direct van persoon tot persoon interactie of indirect door contact met besmet voedsel, water en milieu oppervlakken. Noroviruses kan worden afgestoten langdurig en verlengde overleving van het virus omgevingsoppervlakken is gedocumenteerd ^{1, 2, 3.} Tijdens drukke verlies, miljarden virusdeeltjes vrijkomt per gram ontlasting en braaksel bevat ook een voldoende aantal virale deeltjes infectie ^{4, 5, 6, 7, 8 veroorzaken,}ef "> ^{9, 10.} Bovendien kan de overdracht van het virus tussen levenloze oppervlakken en menselijke huid gemakkelijk voordoen ^{2, 11, 12.} Derhalve kunnen de controle van milieuverontreiniging helpen uitbraak onderzoeken en evalueren van de doelmatigheid van sanering en desinfectie procedures.

Milieubemonstering verschillende protocollen zijn beschreven voor de detectie van rotavirus, colifaag MS2, feline calicivirus (FCV), en bacteriofaag P22 ^{13, 14, 15, 16.} De in deze studies, waaronder snelle uitdroging (<1 uur) en de kleine oppervlakte beschreven valideringsomstandigheden (25 x 100 cm ^2), mogelijk onvoldoende lokale instellingen vertegenwoordigen. Bovendien, de verwachte geringe besmetting met envinmental oppervlakken moeten protocollen die in staat zijn om heel weinig virusdeeltjes te detecteren zijn.

We ontwikkelden een-macroschuim gebaseerde oppervlak sampling methode voor de detectie en typering van norovirus. Deze methode is gevalideerd in meerdere norovirus uitbraken. Het protocol bevat 1) hoe staafje monsters van het milieu oppervlakken te verzamelen (2) hoe u het beste te onderhouden integriteit van de monsters tijdens het verzamelen en verzending naar het laboratorium, en 3) laboratorium testen en typering van norovirus.

Protocol

1. Swab Sampling in het veld Draag een schone paar handschoenen. Meten van de grootte van bemonsteringsplaats zonder het oppervlak met een meetlint of liniaal. Probeer om het gebied zo goed mogelijk te schatten en invullen van een meldingsformulier (aanvullende tabel 1). Controleer de swab-kit voor eventuele lekkages en het label monster transport tassen en swab kits. Verplaats het staafje over de bemonstering gebied als volgt: een slag in horizontale richting, e…

Representative Results

Figuur 1 toont een stroomdiagram van het staafje bemonsteringsprotocol. Dit protocol bestaat uit vier stappen; 1) monstername, 2) sample opslag en het transport, 3) viraal RNA zuivering en concentratie en 4) RT-qPCR assay en genotypering. Figuur 1: Stroomdiagram van de definitieve protocol voor het milieu oppervlakte bemonstering v…

Discussion

Noroviruses een menselijke infectieuze dosis 50% tussen 18 en 10 ^{3 20} virusdeeltjes. Daarom kan zelfs low-level vervuiling van oppervlakken een gevaar voor de volksgezondheid opleveren. Verschillende aspecten van het staafje bemonsteringsprotocol geëvalueerd waaronder: 1) verschillende swab materialen, 2) opslagpositie swabs tijdens transport, 3) viraal RNA-concentratie, en 4) colifaag MS2 extractie als interne controle.

Tot voor kort was alleen de prestat…

Materials

Generic name for kits
Macrofoam swab	Premoistened EnviroMax Swab kit	Puritan	2588060PFUW
RNA Lysis buffer	CDC UNEX buffer	Microbiologics	Cat No MR0501
RNA extraction spin column	Midi column	Omega Biotek	Cat No R6664-02
RNA purification spin column	Zymol RNA Clean and Concentrator kit	Zymo Research	Cat No R1016
Real time RT-PCR kit	AgPath kit One-Step RT-PCR Kit	Life Technologies	Cat No 4387391
Conventional RT-PCR kit	Qiagen one step RT-PCR kit	Qiagen kit	Cat No 210212
Gel extraction kit	Qiagen QIAquick gel extraction kit	Qiagen kit	Cat No 28704 or 28706
	Coliphage MS2	ATCC	Cat No 15597-B1
	RNA run-off transcripts			Bacteriophage MS2 (ATCC No. 15597-B1) can be cultivated using Escherichia coli (E.coli) Famp (ATCC No. 700891).
	Realtime PCR platform	Applied Biosystems	Model ABI 7500	GI and GII RNA run off transcripts were quantified spectrophotometrically at A260, diluted in diethyl pyrocarbonate-treated water to 1 × 106 copies/ μl, and stored at −80°C with 1.0 U /μl RNasin (Promega, Madison, WI).
	Optical 96-well reaction plate	Thermo Scientific	Cat No 4316813
	MicroAmp Clear Adhesive Film	Thermo Scientific	Cat No 4306311