Pinne Prøvetaking metode for påvisning av humant Norovirus på overflater

Summary

A macrofoam based sampling methodology was developed and evaluated for the detection and quantification of norovirus on environmental hard surfaces.

Abstract

Menneske noroviruses er en ledende årsak til epidemien og sporadisk gastroenteritt på verdensbasis. Fordi de fleste infeksjoner er enten spres direkte via person-til-person rute eller indirekte gjennom miljø overflater eller mat, forurenset fomites og livløse overflater er viktige kjøretøy for spredning av viruset i løpet av norovirus-utbrudd.

Vi utviklet og evaluert en protokoll ved hjelp macrofoam vattpinner for påvisning og typing av menneskelige noroviruses fra harde overflater. Sammenlignet med fiber-tipped vattpinner eller antistatiske våtservietter, macrofoam vattpinner tillate virus recovery (range 1,2 til 33,6%) fra toalettsete flater på opp til 700 cm ^2. Protokollen omfatter trinn for utvinning av viruset fra vattpinner og ytterligere konsentrasjon av det virale RNA ved å bruke spinnkolonner. Totalt 127 (58,5%) av 217 penselprøver som hadde blitt samlet inn fra overflater i cruiseskip og langsiktig omsorg anlegg hvor norovirus gastroenteritt hadde værtrapportert testet positivt for GII norovirus ved RT-qPCR. Av disse var 29 (22,8%) kunne med hell genotypede. I konklusjonen, påvisning av norovirus om miljø overflater ved hjelp av protokollen vi utviklet kan bistå i å bestemme nivået av miljøforurensning ved utbrudd samt påvisning av virus når kliniske prøver er ikke tilgjengelig; det kan også legge til rette for overvåking av effektiviteten av utbedring strategier.

Introduction

Menneske noroviruses er en ledende årsak til epidemien og sporadisk akutt gastroenteritt på verdensbasis ^{en, to, tre.} Viruset er svært smittsom og overføring skjer ved direkte person til person interaksjon eller indirekte gjennom kontakt med forurenset mat, vann eller miljømessige overflater. Noroviruses kan kaste i lengre perioder og forlenget overlevelse av virus på miljø overflater er dokumentert ^{en, to, tre.} Under topp shedding, er milliarder av viruspartikler frigjort pr gram avføring, og oppkast også inneholder et tilstrekkelig antall viruspartikler for å forårsake infeksjon ^{4, 5, 6, 7, 8,}ef "> ^{9, 10.} I tillegg kan overføring av viruset mellom døde overflater og human hud lett oppstå i ^{2, 11, 12.} Det kan således overvåkning av miljøforurensning bistå i utbrudds undersøkelser og i å vurdere effektiviteten av rensing og desinfeksjonsrutiner.

Flere miljøprøvetakings protokoller er blitt beskrevet for deteksjon av rotavirus, coliphage MS2, feline calicivirus (FCV), og bakteriofag P22 ^{13, 14, 15, 16.} Imidlertid validerings betingelser som er beskrevet i disse studier, inkludert rask uttørking (<1 time) og små overflateområder (25 x 100 cm ^2), kan det ikke tilstrekkelig representere feltinnstillinger. I tillegg forventes lave forurensningsnivåer av Environmental overflater krever protokoller som er i stand til å oppdage svært få viruspartikler.

Vi utviklet en macrofoam basert overflate prøvetaking metode for påvisning og typing av norovirus. Denne metoden er validert i flere norovirus-utbrudd. Protokollen inkluderer 1) hvordan å samle penselprøver fra miljø overflater (2) hvordan du best kan opprettholde integriteten av prøvene under innsamling og forsendelse til laboratoriet, og 3) laboratorietesting og typing av norovirus.

Protocol

1. Swab Prøvetaking i felt Bruk en ren par hansker. Måle størrelsen på samplingsområdet uten å berøre overflaten ved hjelp av et målebånd eller linjal. Prøv å anslå området så nøyaktig som mulig og fylle ut et rapportskjema (Supplerende tabell 1). Sjekk pinne kit for mulige lekkasjer og etiketten prøvetransportveske og penselsett. Flytt pinnen over prøvetakingsområdet som følger: ett slag i horisontal retning, ett slag i vertikal retning, og et…

Representative Results

Figur 1 viser et flytskjema av prøvetagnings vattpinnen protokollen. Denne protokollen består av fire hovedtrinn; 1) prøvetaking, 2) prøveoppbevaring og transport, 3) viralt RNA rensning og konsentrasjon og 4) RT-qPCR-analyse og genotyping. Figur 1: Flytskjema av den endelige protokollen for miljø overflaten prøvetaking av nor…

Discussion

Noroviruses har en 50% menneskelig smittende dose mellom 18 og 10 ^tre viruspartikler ^20. Derfor kan til og med lavt nivå forurensning av overflater utgjør et offentlig helserisikoen. Flere aspekter av prøvetakingspinne protokollen ble evaluert inkludert: 1) ulike pensel materialer, 2) oppbevaring tilstand spinner under transport, 3) viral RNA konsentrasjon, og 4) coliphage MS2 som intern utvinning kontroll.

Inntil nylig hadde bare resultatene for kompres…

Materials

Generic name for kits
Macrofoam swab	Premoistened EnviroMax Swab kit	Puritan	2588060PFUW
RNA Lysis buffer	CDC UNEX buffer	Microbiologics	Cat No MR0501
RNA extraction spin column	Midi column	Omega Biotek	Cat No R6664-02
RNA purification spin column	Zymol RNA Clean and Concentrator kit	Zymo Research	Cat No R1016
Real time RT-PCR kit	AgPath kit One-Step RT-PCR Kit	Life Technologies	Cat No 4387391
Conventional RT-PCR kit	Qiagen one step RT-PCR kit	Qiagen kit	Cat No 210212
Gel extraction kit	Qiagen QIAquick gel extraction kit	Qiagen kit	Cat No 28704 or 28706
	Coliphage MS2	ATCC	Cat No 15597-B1
	RNA run-off transcripts			Bacteriophage MS2 (ATCC No. 15597-B1) can be cultivated using Escherichia coli (E.coli) Famp (ATCC No. 700891).
	Realtime PCR platform	Applied Biosystems	Model ABI 7500	GI and GII RNA run off transcripts were quantified spectrophotometrically at A260, diluted in diethyl pyrocarbonate-treated water to 1 × 106 copies/ μl, and stored at −80°C with 1.0 U /μl RNasin (Promega, Madison, WI).
	Optical 96-well reaction plate	Thermo Scientific	Cat No 4316813
	MicroAmp Clear Adhesive Film	Thermo Scientific	Cat No 4306311