Метод тампон Отбор проб для обнаружения человека норовирус на поверхностях

Summary

A macrofoam based sampling methodology was developed and evaluated for the detection and quantification of norovirus on environmental hard surfaces.

Abstract

Человеческие Noroviruses являются ведущей причиной эпидемии и спорадической гастроэнтерита во всем мире. Поскольку большинство инфекций либо передаваться непосредственно по маршруту от человека к человеку или косвенно через экологические поверхностей или продуктов питания, загрязненных фомиты и неживые поверхности являются важными инструментами для распространения вируса во время вспышек норовируса.

Мы разработали и оценили протокол с использованием макропена мазки для обнаружения и типирования человека норовирусами с твердых поверхностей. По сравнению с волокном тампоны или антистатическими салфетками, макропена тампоны позволяют восстановление вируса (диапазон 1.2-33.6%) от поверхностей сиденье для унитаза до 700 см ^2. Протокол включает в себя шаги для извлечения вируса из смывов и дальнейшей концентрации вирусной РНК с использованием спиновых столбцов. В общей сложности 127 (58,5%) из 217 образцов мазков, которые были собраны с поверхности в круизных судах и учреждениях длительного ухода, где были норовирус гастроэнтеритсообщили положительный результат на GII норовируса по RT-КПЦР. Из них 29 (22,8%), может быть с успехом проведено генотипирование. В заключение, обнаружение норовируса по экологическим поверхностей с использованием протокола было разработано может помочь в определении уровня загрязнения окружающей среды во время вспышек, а также обнаружения вируса, когда клинические образцы не доступен; она может также способствовать мониторинг эффективности стратегий реабилитации.

Introduction

Человеческие Noroviruses являются ведущей причиной эпидемии и спорадической острого гастроэнтерита во всем мире ^{1, 2, 3.} Вирус чрезвычайно заразен и передача происходит путем прямого человека к человеку взаимодействия или косвенно через контакт с зараженной пищей, водой или экологических поверхностей. Норовирусы может быть пролита в течение длительных периодов времени и длительное выживание вируса на экологических поверхностях было зарегистрировано ^{1, 2, 3.} В пик линьки миллиарды вирусных частиц освобождаются на грамм фекалий, а также рвотные массы содержит достаточное количество вирусных частиц , чтобы вызвать инфекцию ^{4, 5, 6, 7, 8,}эф "> ^{9, 10.} Кроме того, передача вируса между неодушевленных поверхностей и кожи человека может произойти легко ^{2, 11, 12.} Таким образом, мониторинг загрязнения окружающей среды может помочь в расследовании вспышек эпидемий и при оценке эффективности очистки и процедуры дезинфекции.

Несколько протоколов отбора проб окружающей среды были описаны для обнаружения ротавирусов, колифага МС2, калицивироз (FCV), и бактериофаг Р22 ^{13, 14, 15, 16.} Тем не менее, условия проверки , описанные в этих исследованиях, в том числе быстрого иссушения (<1 час) и небольших участков поверхности (25 х 100 см ^2), не может адекватно представлять настройки полей. Кроме того, ожидается, низкие уровень загрязнения ENVIROnmental поверхности требуют протоколы, которые способны обнаружить очень мало вирусных частиц.

Мы разработали макропена на основе метода дискретизации поверхности для обнаружения и типирования норовирус. Этот метод был утвержден в течение нескольких норовируса вспышек. Протокол включает в себя 1), как собирать образцы мазков из окружающей среды поверхностей (2), как наилучшим образом сохранить целостность образцов во время сбора и доставки в лабораторию, и 3) лабораторные испытания и типирование норовирус.

Protocol

1. Тампон Отбор проб в поле Носите чистую пару перчаток. Измерьте размер области выборки, не касаясь поверхности с помощью измерительной ленты или линейки. Попробуйте оценить область как можно более точно и заполнить форму отчета (Дополнительная таблица 1). Про?…

Representative Results

На рисунке 1 показана блок – схема протокола отбора проб тампоном. Этот протокол состоит из четырех основных этапов; 1) сбор образцов, 2) хранения и транспортировки пробы, 3) вирусной РНК очистки и концентрирования и 4) RT-КПЦР анализ и генотипирование. <p class="jove_cont…

Discussion

Норовирусы имеют 50% человеческого инфекционную дозу между 18 и 10 ³ вирусных частиц ^20. Поэтому, даже загрязнение низкого уровня поверхности может представлять опасность для здоровья населения. Некоторые аспекты протокола отбора проб тампоном были оценены в том числе: 1…

Materials

Generic name for kits
Macrofoam swab	Premoistened EnviroMax Swab kit	Puritan	2588060PFUW
RNA Lysis buffer	CDC UNEX buffer	Microbiologics	Cat No MR0501
RNA extraction spin column	Midi column	Omega Biotek	Cat No R6664-02
RNA purification spin column	Zymol RNA Clean and Concentrator kit	Zymo Research	Cat No R1016
Real time RT-PCR kit	AgPath kit One-Step RT-PCR Kit	Life Technologies	Cat No 4387391
Conventional RT-PCR kit	Qiagen one step RT-PCR kit	Qiagen kit	Cat No 210212
Gel extraction kit	Qiagen QIAquick gel extraction kit	Qiagen kit	Cat No 28704 or 28706
	Coliphage MS2	ATCC	Cat No 15597-B1
	RNA run-off transcripts			Bacteriophage MS2 (ATCC No. 15597-B1) can be cultivated using Escherichia coli (E.coli) Famp (ATCC No. 700891).
	Realtime PCR platform	Applied Biosystems	Model ABI 7500	GI and GII RNA run off transcripts were quantified spectrophotometrically at A260, diluted in diethyl pyrocarbonate-treated water to 1 × 106 copies/ μl, and stored at −80°C with 1.0 U /μl RNasin (Promega, Madison, WI).
	Optical 96-well reaction plate	Thermo Scientific	Cat No 4316813
	MicroAmp Clear Adhesive Film	Thermo Scientific	Cat No 4306311