פיתוח של מערכת מסירת DNA החסכוני ידי "Acufection" ויישומו מחקר עור
Summary
פרוטוקול זה מהווה חלופה חסכונית להיבעת פלסמיד דנ"א עירומה עור עכבר. המטרה הכללית של הפרוטוקול היא לספק גנים חיסוניים הקשורות לתוך רקמות עור כדי להתוות את התפקיד הפונקציונלי של גן ספציפי דלקת עורית.
Abstract
חוסר ויסות תגובה חיסונית עור קשור מחלות עור אדם רבות. העברה ישירה של גנים חיסוניים הקשורות לתוך רקמת עור היא גישה מרתקת לחקור אפנון חיסון של דלקת עורית בעכברי מודל של מחלות אנושיות. כאן אנו מציגים פרוטוקול חסכוני כי נמסר DNA עירומה עור עכבר ומוביל ביטוי transgene. השיטה שטבע "acufection", המציין fection טרנס בתיווך לנקב ACU DNA. כדי לבצע acufection, עכבר עור היה חדור ראשון עם ה- DNA פוספט שנאגר מלוח (PBS) ולאחר מכן דקר בקלילות עם חבילה של מחטי דיקור כדי להקל על קליטת ה- DNA ואת transfection לתוך תאים. ה- DNA פלסמיד כנראה נלקח על ידי keratinocyte ותאים דנדריטיים (DCS) בעור והביע לתוך חלבון. שמוק מכני עם מחטים כשלעצמה לא לגרום נזק לעור או לגרום ההפעלה keratinocyte. הביטוישל גנים טרנספקציה אותרה בעור ברמות תעתיק ו translational הן הבאות acufection עבור 2 ימים ומתוחזק עד 7 ימים. המטרה העיקרית לפיתוח שיטה acufection זה היה כדי לחקור איזופורם מוגדר בעבר של IL-15. באמצעות שיטה זו, איזופורם שחבור חלופי IL-15 עם 7 אקסון נמחק חלקית (IL-15ΔE7) הובעה בעור ובהמשך מטופלים עם קולטן אגרה דמוי 7 (TLR7) אגוניסט, imiquimod (IMQ), כדי לגרום לדלקת. Acufection-נמסר IL-15ΔE7 בעור מודחקים התפשטות keratinocyte, עובי אפידרמיס גיוס נויטרופילים דלקת עורית הנגרמת IMQ. עם הגדלת ריבית בזיהוי מנגנוני הוויסות של דלקת עורית, הפרוטוקול המתואר כאן מספק אלטרנטיבה יעילה תכליתית עלות למערכת אקדח הגנים או microseeding למסירת DNA in vivo. זה עלול פוטנציאלי לאפשר גילוי הפונקציה של רומןהגן בעור או לחקירת הטיפול החדש למחלות עורית.
Introduction
העור הוא קו ההגנה הראשון המארח. קרטינוציטים (KCS) הם סוג התאים העיקרי בעור של בני אדם ועכברים. בתגובה לגירויים סביבתיים (למשל השמש, חמצן, כימיקלים הפלישה פתוגניים), KCS מופעלים לייצר מגוון רחב של ציטוקינים מעודדי דלקת וכמוקינים כגון IL-8, IL-6, IL-1α, IL-1β, TNF- α ו- GM-CSF 1. יחד הם מפעילים את הגיוס של תאי מערכת החיסון של העור. דלקת עורית מחמירות קשורה לעיתים קרובות עם מחלות אנושיות רבות כולל דלקת עור ממגע אקטופי חריפה ודלקת בתיווך התא T כרונית (דלקת עור אלרגית ממגע למשל ופסוריאזיס) 2. ויסות תגובות מעודדות דלקת בעור על ידי עיכוב הפעלת KC היא גישה סבירה לטיפול בדלקת עורית. פרוטוקול זה מתאר גישה חדשה לבטא את גן ציטוקינים זמני האפידרמיס על מנת ללמוד מיל חיסוניponse תוצאתי כדי טיפול כזה בעור.
האפידרמיס מלחין השכבה השטחית ביותר של העור. הוא משמש כמחסום פיזי שמירת חומרים חיצוניים כגון חומצות גרעין ופתוגנים מלהיכנס לשכבות העמוקות של העור. כמה טכניקות מחט ללא הוקמו DNA אפידרמיס העברת 3, 4. דנ"א בתמיסה או הקשורים ליפוזומים קטיוני או וקטורים אדנווירוס יושם ישירות האפידרמיס שונה עם טכניקות כגון הסרת השכבה הקרנית או הטיפול עם depilating מגיב. הסרת האפיתל cornified מקל DNA חציית מחסום האפידרמיס ואינטראקציה עם קרטינוציטים ותאי לנגרהנס לגרום תגובה חיסונית 5. בעוד שטח פנים גדול זמין עבור העברת דנ"א גישה זו אינה כרוכה מחטים, ישנם חסרונות לרבות הדרישהעבור הכמויות הגדולות של DNA (10 – 100 מיקרוגרם), יחס קשה על העור על ידי הפשטה, ואת התוצאות לא העקביות בזירוז תגובה חיסונית של חיות המחוסנות בלי מאיץ משלוח DNA 6. Microparticle בתיווך משלוח תאי של DNA ערום אל העור הוכח להיות יעיל מאוד לשחזור גרימת תגובה חיסונית 7, 8. אקדח גני כף יד נעשה שימוש כדי להפציץ את אתר יעד עור עם חלקיקי זהב מצופה פלסמיד דנ"א 2 מיקרומטר בקוטר בגודל באמצעות זרימת אוויר הליום בלחץ 9. ה- DNA פלסמיד כנראה הוא נלקח על ידי תאים דנדריטים KCsand (DCS) בעור ואת החלבון מתבטא באופן מקומי או מועברים ניקוז בלוטות הלימפה ידי DCs 10. למרות שמערכת אקדח גנים היא פשוטה ודורשת ניסיון טכני מוגבל, העלות להכנה ושולח את "bul DNAתן "(כלומר אבקות זהב, גז הליום) ועבור אקדח הגן עצמו הגביל היישום הכללי שלה. בנוסף, הדרישה עבור מערכת הולכת גז הליום מגביל את הקלות של תחבורה אקדח גנים כאשר הניסויים נערכים במקומות שונים. Microseeding הודגם להשיג יעילות גבוהה יותר של העברת גנים מ זריקה אחת חלקיקי הפגזה 11. Microseeding משתמשת אקדח קעקוע להעביר דנ"א לעור ללא שימוש חרוזי חלקיקים 11. מתנודד microneedles על העור באמצעות גישה זו עשוי ישירות לגרד את קרום התא ובכך להעביר DNA לתאים מרובים בו זמנית. עם זאת, הכאב הקשור למספר רב של זריקות עם מחטים 0.254 מ"מ בקוטר הוא חיסרון.
כאן אנו מספקים גישה חלופית למסירת DNA in vivo. את "acufection" </strאונג> פרוטוקול שתיארנו כאן מספק דרך חסכונית ויעילה כדי לספק פלסמיד דנ"א בעור העכבר. בקצרה, עשר מחטי הדיקור (0.2 מ"מ קוטר x 13 מ"מ אורך) היו כבולים צרור ידי דבק. נפח של 10 μL של PBS עם 10 מיקרוגרם של ה- DNA פלסמיד המכיל את הגן של העניין הושם על עור אגף המגולח, מקריח שטופל בקרם. באמצעות חבילה מחט דיקור להתנדנד המשטח (1 ס"מ x 1 ס"מ) של העור, keratins על שכבת חרמן התרופפו ואת פלסמיד דנ"א מיושם על פני השטח נטמע האפידרמיס. ניזק לעור היה פיקוח ונמצא מינימאלי. ביטוי של גן טרנספקציה בעור acufected אושר על ידי שני כמוני בזמן האמת PCR (qRT-PCR) ו- ELISA. השפעות modulatory החיסוניות של-נמסר acufection IL-15ΔE7 על דלקת עורית הודגמו באמצעות מודל עכבר מטופל-IMQ 12. בעוד acufection מוכיח להיות Dema קל ופחותnding שיטה למסירה DNA in vivo, את הכמות האופטימלית של DNA עבור גנים שונים בזמנים לדקור את העור צריך להיות מותאם בקפידה כדי להשיג תוצאות לשחזור.
Protocol
Representative Results
Discussion
השלב הקריטי ביותר להבטיח את הביטוי של פלסמיד דנ"א acufected הוא להתנדנד באופן שווה לשחרר את שכבת חרמן העור. בעוד דוחף מחטים בעדינות בלי לחתוך את העור, הכוח צריך להיות מספיק חזק כדי לדכא את השטח. כדי להקל על קליטת ה- DNA בתמיסה 10 μL על פני שטח 1 ס"מ x 1 ס"מ, מחטים צריך להתנד?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענק מטעם משרד המדע והטכנולוגיה (MOST 103-2633-B-002-002; 104-2320-B-002-048). אנו מודים בני זוג. בטי וו-צ'יי Chien-קואו לי בבית NTU, ליי זרבוני באוניברסיטת סטנפורד וד"ר פיטר הופמן באוניברסיטת הוואי לקריאת כתב היד, יון Chien ב NTU לקבלת סיוע טכני, וד"ר וון-צ'י וויי ב ביוטכנולוגיה החקלאות מרכז המחקר בבית Academia Sinica לקבלת ייעוץ טכני.
Materials
| Accu Handy Needle | Accu | 36Gx0.5 | Medical device |
| NairTM Lotion | Church & Dwight | N/A | Use to remove hair |
| Shandon Xyline substitute | Thermo Fisher Scientific | 6764506 | Deparaffinization |
| Avertin (2,2,2-Tribromethanol) | Sigma-Aldrich | T4,840-2 | Anesthesia |
| 2-methyl-2-butanol | Sigma-Aldrich | 152463 | Solvent for the dissolution of avertin |
| DifcoTM LB broth, Miller | BD | 244620 | Propagation and maintenance of E. coli for molecular biology |
| QIAGENⓇ Plasmid Midi Kit | QIAGEN | 12143 | Purification of plasmid DNA from E. coli |
| Mouse IL-15/IL-15R Complex ELISA Ready-SET-Go kit | eBioscience | 88-7215 | Measure IL-15 protein |
| Anti-mouse Ly6G | BioLegend | 127601 | Antibody used for immunohistochemical stain |
| anti-mouse Ki-67 | eBioscience | 14-5698-80 | Antibody used for immunohistochemical stain |
| Simple Stain Mouse MAXPO (Rat) | Nichirei Biosciences | 414341F | Reagent to block background signal in mouse-on-mouse stain |
| DAB Peroxidase (HRP) Substrate Kit | Vector Laboratories | SK-4100 | Peroxidse substrate for immunohistochemical stain |
| Ultra V block | Thermo Fisher Scientific | TA-060-UB | Reduce nonspecific background staining |
| Methyl green | Sigma-Aldrich | M8884 | Nuclear staining |
| Vecta MountTM | Vector Laboratories | M-5000 | Permanently preserving histochemical stains |
| Protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 04-693-116-001 | Inhibit protease activity in cell lysate |
| Aldara cream | 3M Parmaceuticals | N/A | 5% imiquimod cream |
| Bessman Tissue Pulverizer | Spectrum Labs | 189475 | Use to pulverize skin tissue |
| ABI7900HT cycler | Thermo Fisher Scientific | N/A | quantitative real-time PCR assay |
| Camcorder | Panasonic | HDC-SD60 | Image documentation |
| Axio Scope.A1 | ZEISS | N/A | Bright-field microscopy |
| ScanScopeⓇ XT | Aperio | N/A | Whole-field image scanner |
| MetaMorphⓇ Research Imaging | Molecular Devices | N/A | Quantitative analysis of skin thickness and immune-reactive cells |
References
- Effendy, I., Loffler, H., Maibach, H. I. Epidermal cytokines in murine cutaneous irritant responses. Journal of applied toxicology : JAT. 20, 335-341 (2000).
- Nestle, F. O., Di Meglio, P., Qin, J. Z., Nickoloff, B. J. Skin immune sentinels in health and disease. Nature reviews. 9, 679-691 (2009).
- Liu, L. J., et al. Topical application of HIV DNA vaccine with cytokine-expression plasmids induces strong antigen-specific immune responses. Vaccine. 20, 42-48 (2001).
- Lu, B., Federoff, H. J., Wang, Y., Goldsmith, L. A., Scott, G. Topical application of viral vectors for epidermal gene transfer. J Invest Dermatol. 108, 803-808 (1997).
- Partidos, C. D. Delivering vaccines into the skin without needles and syringes. Expert Rev Vaccines. 2, 753-761 (2003).
- Peachman, K. K., Rao, M., Alving, C. R. Immunization with DNA through the skin. Methods. 31, 232-242 (2003).
- Yang, N. S., Burkholder, J., Roberts, B., Martinell, B., McCabe, D. In vivo and in vitro gene transfer to mammalian somatic cells by particle bombardment. Proc Natl Acad Sci U S A. 87, 9568-9572 (1990).
- Tang, D. C., DeVit, M., Johnston, S. A. Genetic immunization is a simple method for eliciting an immune response. Nature. 356, 152-154 (1992).
- Haynes, J. R. Particle-mediated DNA vaccine delivery to the skin. Expert Opin Biol Ther. 4, 889-900 (2004).
- Tuomela, M., et al. Biodistribution and general safety of a naked DNA plasmid, GTU-MultiHIV, in a rat, using a quantitative PCR method. Vaccine. 23, 890-896 (2005).
- Eriksson, E., et al. In vivo gene transfer to skin and wound by microseeding. J Surg Res. 78, 85-91 (1998).
- Lee, T. L., et al. An alternatively spliced IL-15 isoform modulates abrasion-induced keratinocyte activation. J Invest Dermatol. 135, 1329-1337 (2015).
- Rudy, S. J. Imiquimod (Aldara): modifying the immune response. Dermatol Nurs. 14, 268-270 (2002).
- van der Fits, L., et al. Imiquimod-induced psoriasis-like skin inflammation in mice is mediated via the IL-23/IL-17 axis. J Immunol. 182, 5836-5845 (2009).
- Sumida, H., et al. Interplay between CXCR2 and BLT1 facilitates neutrophil infiltration and resultant keratinocyte activation in a murine model of imiquimod-induced psoriasis. J Immunol. 192, 4361-4369 (2014).
- Bamford, R. N., DeFilippis, A. P., Azimi, N., Kurys, G., Waldmann, T. A. The 5′ untranslated region, signal peptide, and the coding sequence of the carboxyl terminus of IL-15 participate in its multifaceted translational control. J Immunol. 160, 4418-4426 (1998).
- Horton, R. M., Hunt, H. D., Ho, S. N., Pullen, J. K., Pease, L. R. Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension. Gene. 77, 61-68 (1989).
- Tan, X., Lefrancois, L. Novel IL-15 isoforms generated by alternative splicing are expressed in the intestinal epithelium. Genes Immun. 7, 407-416 (2006).
- Basner-Tschakarjan, E., Mirmohammadsadegh, A., Baer, A., Hengge, U. R. Uptake and trafficking of DNA in keratinocytes: evidence for DNA-binding proteins. Gene Ther. 11, 765-774 (2004).
- Fan, H., Lin, Q., Morrissey, G. R., Khavari, P. A. Immunization via hair follicles by topical application of naked DNA to normal skin. Nat Biotechnol. 17, 870-872 (1999).
- Kennedy-Crispin, M., et al. Human keratinocytes’ response to injury upregulates CCL20 and other genes linking innate and adaptive immunity. J Invest Dermatol. 132, 105-113 (2012).
