"Acufection" और त्वचा अनुसंधान करने के लिए अपने आवेदन के द्वारा एक आर्थिक डीएनए वितरण प्रणाली का विकास
Summary
यह प्रोटोकॉल माउस त्वचा में नग्न प्लाज्मिड डीएनए व्यक्त करने के लिए एक लागत प्रभावी विकल्प है। प्रोटोकॉल के समग्र लक्ष्य त्वचीय सूजन में एक विशिष्ट जीन की कार्यात्मक भूमिका चित्रित करने के लिए त्वचा के ऊतकों में प्रतिरक्षा से संबंधित जीन प्रदान करने के लिए है।
Abstract
त्वचा में प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के अनियंत्रण कई मानव त्वचा विकारों के साथ जुड़ा हुआ है। त्वचा के ऊतकों में प्रतिरक्षा संबंधित जीन का सीधा हस्तांतरण एक आकर्षक दृष्टिकोण मानव रोगों के माउस मॉडल में त्वचीय सूजन की प्रतिरक्षा मॉडुलन जांच करने के लिए है। यहाँ हम एक लागत प्रभावी प्रोटोकॉल है कि माउस त्वचा में नग्न डी एन ए को जन्म दिया और ट्रांस्जीन अभिव्यक्ति की ओर जाता है प्रस्तुत करते हैं। विधि "acufection" गढ़ा है, एसीयू पंचर की मध्यस्थता डीएनए ट्रांस fection को संकेतित करते। acufection करने के लिए, माउस त्वचा पहले फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) में डीएनए के साथ संचार किया गया था और उसके बाद डीएनए के अवशोषण और कोशिकाओं में अभिकर्मक की सुविधा के लिए एक्यूपंक्चर सुइयों का एक बंडल के साथ हल्के से चुभ। प्लाज्मिड डीएनए शायद keratinocyte और त्वचा में वृक्ष के समान कोशिकाओं (डीसी) द्वारा लिया और प्रोटीन में व्यक्त किया जाता है। सुई से प्रति के साथ मैकेनिकल चुभन त्वचा को नुकसान का कारण या keratinocyte सक्रियण प्रेरित नहीं किया। भावट्रांसफ़ेक्ट जीनों के 2 दिनों के लिए acufection निम्नलिखित दोनों ट्रांस्क्रिप्शनल और अनुवादकीय स्तरों पर त्वचा में पता चला और 7 दिन तक बनाए रखा गया था। इस acufection विधि के विकास के लिए प्राथमिक लक्ष्य आईएल 15 के एक पहले से अपरिभाषित isoform जांच करने के लिए किया गया था। इस विधि, आंशिक रूप से नष्ट कर दिया एक्सॉन 7 (आईएल 15ΔE7) के साथ वैकल्पिक रूप से spliced आईएल 15 isoform उपयोग कर रहा था त्वचा में व्यक्त किया और बाद में एक टोल की तरह रिसेप्टर 7 (TLR7) एगोनिस्ट, Imiquimod (IMQ) के साथ इलाज, सूजन प्रेरित करती थीं। Acufection वितरित त्वचा में आईएल 15ΔE7 IMQ प्रेरित त्वचीय सूजन में keratinocyte प्रसार, एपिडर्मल मोटाई और न्युट्रोफिल भर्ती को दबा दिया। त्वचा संबंधी सूजन के नियामक तंत्रों की पहचान करने में रुचि वृद्धि के साथ, प्रोटोकॉल यहाँ वर्णित जीन बंदूक प्रणाली या विवो में डीएनए प्रसव के लिए microseeding करने के लिए एक लागत प्रभावी और बहुमुखी विकल्प प्रदान करता है। यह संभवतः एक उपन्यास के समारोह की खोज के लिए अनुमति दे सकतात्वचा में या त्वचा संबंधी रोगों के लिए नए उपचार की जांच के लिए जीन।
Introduction
त्वचा मेजबान रक्षा की पहली पंक्ति है। केरेटिनकोशिकाएं (सी एस) मनुष्यों और चूहों की त्वचा में प्रमुख सेल प्रकार हैं। पर्यावरण उत्तेजनाओं (जैसे सूरज की रोशनी, ऑक्सीजन, रसायन और रोगजनक आक्रमण) के जवाब में, के सी एस सक्रिय और proinflammatory साइटोकिन्स और इस तरह के आईएल 8, आईएल -6, आईएल 1α, आईएल 1β, TNF- रूप chemokines की एक विस्तृत सरणी का उत्पादन कर रहे हैं α और जीएम-सीएसएफ 1। साथ में वे त्वचा के लिए प्रतिरक्षा कोशिकाओं की भर्ती ट्रिगर। बहुत बिगड़ त्वचीय सूजन अक्सर तीव्र अस्थानिक संपर्क जिल्द की सूजन और क्रोनिक टी सेल की मध्यस्थता सूजन (जैसे एलर्जी संपर्क जिल्द की सूजन और सोरायसिस) 2 सहित कई मानव रोगों के साथ जुड़ा हुआ है। केसी सक्रियण बाधा त्वचा में समर्थक भड़काऊ प्रतिक्रियाओं modulating एक सुखद दृष्टिकोण त्वचीय सूजन के इलाज के लिए है। यह प्रोटोकॉल एक नए दृष्टिकोण का वर्णन करता है क्षणिक प्रतिरक्षा रेस अध्ययन करने के लिए बाह्य त्वचा में साइटोकाइन जीन व्यक्त करने के लिएponse त्वचा में इस तरह के एक उपचार के लिए परिणामी।
एपिडर्मिस त्वचा का सबसे ऊपरी सतह तैयार करता। यह एक शारीरिक बाधा ऐसे न्यूक्लिक एसिड और त्वचा की गहरी परतों में प्रवेश करने से रोगज़नक़ों के रूप में बाहरी पदार्थ रखने के रूप में कार्य करता है। कई सुई से मुक्त तकनीक एपिडर्मल डीएनए हस्तांतरण 3, 4 के लिए स्थापित किया गया है। समाधान में डीएनए या धनायनित लिपिड या एडीनोवायरस वैक्टर के साथ जुड़े सीधे इस तरह परत कॉर्नियम को हटाने या अभिकर्मक depilating साथ इलाज के रूप में बाह्य त्वचा तकनीक के साथ संशोधित करने के लिए लागू किया गया है। श्रृंगित उपकला की हटाने डीएनए एपिडर्मल बाधा और केरेटिनकोशिकाओं और Langerhans कोशिकाओं के साथ बातचीत को पार 5 प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के लिए प्रेरित करने की सुविधा। जबकि एक बड़ा सतह क्षेत्र डीएनए हस्तांतरण के लिए उपलब्ध है और इस दृष्टिकोण सुइयों को शामिल नहीं करता है, वहाँ आवश्यकता सहित नुकसान कर रहे हैंअलग करना द्वारा – (100 माइक्रोग्राम 10), त्वचा पर कठोर उपचार, और डीएनए वितरण बूस्टर 6 बिना प्रतिरक्षित पशुओं में प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया उत्प्रेरण में असंगत परिणाम डीएनए की एक बड़ी मात्रा के लिए। Microparticle की मध्यस्थता त्वचा के लिए नग्न डीएनए के intracellular वितरण अत्यधिक कुशल और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया 7, 8 उत्प्रेरण के लिए प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य होने के लिए दिखाया गया है। एक हाथ से आयोजित किया जीन बंदूक प्लाज्मिड डीएनए लेपित सोने के कणों दबाव हीलियम हवा का प्रवाह 9 के माध्यम से आकार में 2 सुक्ष्ममापी व्यास के साथ त्वचा लक्ष्य साइट बौछार करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। प्लाज्मिड डीएनए शायद त्वचा में KCsand वृक्ष के समान कोशिकाओं (डीसी) द्वारा लिया जाता है और प्रोटीन स्थानीय रूप से व्यक्त किया जाता है या डीसी 10 से draining लिम्फ नोड्स के लिए ले जाया जा रहा है। हालांकि जीन बंदूक प्रणाली सरल है और सीमित तकनीकी अनुभव, तैयारी और "डीएनए बुल देने के लिए लागत की आवश्यकता हैचलो "(यानी सोने पाउडर, हीलियम गैस) और जीन बंदूक के लिए ही अपने सामान्य आवेदन सीमित है। इसके अतिरिक्त, एक हीलियम गैस वितरण प्रणाली के लिए आवश्यकता जीन बंदूक परिवहन में आसानी को सीमित करता है जब प्रयोगों विभिन्न स्थानों पर आयोजित की जाती हैं। Microseeding एक इंजेक्शन और कण बमबारी 11 से जीन स्थानांतरण के एक उच्च दक्षता प्राप्त करने के प्रदर्शन किया गया है। Microseeding कण मोती के उपयोग के बिना त्वचा के लिए डीएनए वितरित करने के लिए एक टैटू बंदूक का उपयोग करता है 11। दोलन त्वचा इस दृष्टिकोण का उपयोग करने पर microneedles की संभावना है सीधे कोशिका झिल्ली को स्क्रैप और इस तरह एक ही समय में कई कक्षों के लिए डीएनए हस्तांतरण। हालांकि, 0.254 मिमी व्यास सुइयों के साथ इंजेक्शन की बड़ी संख्या के साथ जुड़े दर्द एक नुकसान है।
यहाँ हम विवो में डीएनए वितरण लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण प्रदान करते हैं। "Acufection" </strओंग> प्रोटोकॉल हम यहाँ वर्णित माउस त्वचा में प्लाज्मिड डीएनए वितरित करने के लिए एक किफायती और कारगर तरीका प्रदान करता है। संक्षेप में, दस एक्यूपंक्चर सुई (व्यास लंबाई में x 13 मिमी में 0.2 मिमी) चिपकने वाला टेप से एक बंडल में बंधे थे। प्लाज्मिड ब्याज की ट्रांस्जीन युक्त डीएनए के 10 माइक्रोग्राम प्रति के साथ पीबीएस के 10 μL का एक मात्रा मुंडा, लोमनाशक क्रीम का इलाज पार्श्व त्वचा पर रखा गया था। त्वचा की सतह (1 सेमी x 1 सेमी) दोलन करने एक्यूपंक्चर सुई बंडल का उपयोग करके, सींग का बना हुआ परत पर keratins ढीला कर रहे थे और प्लाज्मिड डीएनए सतह पर प्रयोग किया एपिडर्मिस में समाहित कर लिया गया। त्वचा को नुकसान पर नजर रखी और कम से कम हो पाया था। acufected त्वचा में ट्रांसफ़ेक्ट जीन की अभिव्यक्ति दोनों मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर (QRT- पीसीआर) और एलिसा द्वारा पुष्टि की गई। त्वचा संबंधी सूजन पर acufection वितरित आईएल 15ΔE7 की प्रतिरक्षा modulatory प्रभाव IMQ का इलाज माउस मॉडल 12 का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया था। acufection साबित होता है जबकि एक आसान और कम dema होने के लिएविवो में डीएनए प्रसव के लिए विधि nding, विभिन्न जीनों और कई बार त्वचा चुभन के लिए डीएनए की सर्वोत्कृष्ट मात्रा ध्यान से प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम प्राप्त करने के लिए अनुकूलित किया जाना है।
Protocol
Representative Results
Discussion
acufected प्लाज्मिड डीएनए की अभिव्यक्ति सुनिश्चित करने के लिए सबसे महत्वपूर्ण कदम समान रूप से दोलन और त्वचा की सींग का बना हुआ परत ढीला है। त्वचा काटने के बिना सुई धक्का धीरे करते हैं, बल कठोर सतह दबाना करने ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम के विज्ञान और प्रौद्योगिकी मंत्रालय से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया (मोस्ट 103-2633-B-002-002, 104-2320-B-002-048)। हम डीआरएस धन्यवाद। बेट्टी वू-ह्सिह और NTU में चिएन-कुओ ली, लीघ ज़रबोनी स्टैनफोर्ड विश्वविद्यालय और डॉ पीटर होफ़मैन हवाई विश्वविद्यालय में कम से पांडुलिपि पढ़ने के लिए, तकनीकी सहायता के लिए NTU पर यूं चिएन और कृषि जैव प्रौद्योगिकी में डॉ वेन-ची वेइ तकनीकी सलाह के लिए एकेडेमिया सिनिका पर रिसर्च सेंटर।
Materials
| Accu Handy Needle | Accu | 36Gx0.5 | Medical device |
| NairTM Lotion | Church & Dwight | N/A | Use to remove hair |
| Shandon Xyline substitute | Thermo Fisher Scientific | 6764506 | Deparaffinization |
| Avertin (2,2,2-Tribromethanol) | Sigma-Aldrich | T4,840-2 | Anesthesia |
| 2-methyl-2-butanol | Sigma-Aldrich | 152463 | Solvent for the dissolution of avertin |
| DifcoTM LB broth, Miller | BD | 244620 | Propagation and maintenance of E. coli for molecular biology |
| QIAGENⓇ Plasmid Midi Kit | QIAGEN | 12143 | Purification of plasmid DNA from E. coli |
| Mouse IL-15/IL-15R Complex ELISA Ready-SET-Go kit | eBioscience | 88-7215 | Measure IL-15 protein |
| Anti-mouse Ly6G | BioLegend | 127601 | Antibody used for immunohistochemical stain |
| anti-mouse Ki-67 | eBioscience | 14-5698-80 | Antibody used for immunohistochemical stain |
| Simple Stain Mouse MAXPO (Rat) | Nichirei Biosciences | 414341F | Reagent to block background signal in mouse-on-mouse stain |
| DAB Peroxidase (HRP) Substrate Kit | Vector Laboratories | SK-4100 | Peroxidse substrate for immunohistochemical stain |
| Ultra V block | Thermo Fisher Scientific | TA-060-UB | Reduce nonspecific background staining |
| Methyl green | Sigma-Aldrich | M8884 | Nuclear staining |
| Vecta MountTM | Vector Laboratories | M-5000 | Permanently preserving histochemical stains |
| Protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 04-693-116-001 | Inhibit protease activity in cell lysate |
| Aldara cream | 3M Parmaceuticals | N/A | 5% imiquimod cream |
| Bessman Tissue Pulverizer | Spectrum Labs | 189475 | Use to pulverize skin tissue |
| ABI7900HT cycler | Thermo Fisher Scientific | N/A | quantitative real-time PCR assay |
| Camcorder | Panasonic | HDC-SD60 | Image documentation |
| Axio Scope.A1 | ZEISS | N/A | Bright-field microscopy |
| ScanScopeⓇ XT | Aperio | N/A | Whole-field image scanner |
| MetaMorphⓇ Research Imaging | Molecular Devices | N/A | Quantitative analysis of skin thickness and immune-reactive cells |
References
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