Développement d'un ADN Système économique Livraison par « Acufection » et son application à la recherche de la peau

Résumé

Ce protocole est une alternative rentable pour exprimer l'ADN plasmidique nu dans la peau de la souris. L'objectif général du protocole est de délivrer des gènes liées au système immunitaire dans le tissu de la peau pour délimiter le rôle fonctionnel d'un gène spécifique dans l'inflammation cutanée.

Résumé

Dysrégulation de la réponse immunitaire dans la peau est associée à de nombreux troubles de la peau humaine. transfert direct de gènes liées au système immunitaire dans les tissus de la peau est une approche fascinante pour étudier la modulation immunitaire de l'inflammation cutanée dans les modèles de souris de maladies humaines. Nous présentons ici un protocole rentable qui a livré l'ADN nu dans la peau de la souris et conduit à l'expression du transgène. Le procédé est inventé « acufection », désignant l' ADN trans fection acu à médiation par la perforation. Pour effectuer acufection, la peau de souris a été perfusée avec de l'ADN dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et ensuite piquer légèrement avec un faisceau d'aiguilles d'acupuncture pour faciliter l'absorption de l'ADN et la transfection dans les cellules. L'ADN plasmidique est sans doute repris par le kératinocyte et les cellules dendritiques (CD) dans la peau et exprimé en protéine. Piqûre mécanique avec les aiguilles en tant que tel n'a pas causé de dommages à la peau ou induire l' activation des kératinocytes. L'expressiondes gènes transfectés a été détecté dans la peau à la fois des niveaux transcriptionnels et traductionnels suivants acufection pendant 2 jours et maintenus jusqu'à 7 jours. L'objectif principal pour le développement de cette méthode de acufection était d'étudier une isoforme précédemment définie de l'IL-15. En utilisant cette méthode, une IL-15 isoforme de l'exon 7 (IL-15ΔE7) partiellement supprimé alternativement épissé a été exprimée dans la peau et ensuite traité avec un récepteur de type Toll 7 agoniste (TLR7), imiquimod (IMQ), pour induire une inflammation. IL-15ΔE7 livré Acufection en peau supprimé la prolifération des kératinocytes, l'épaisseur de l'épiderme et le recrutement de neutrophiles dans l'inflammation cutanée induite par IMQ. Avec l'intérêt croissant pour identifier les mécanismes de régulation de l' inflammation cutanée, le protocole décrit ici fournit une alternative rentable et polyvalent pour le système de canon à gènes ou microseeding pour la délivrance d'ADN in vivo. Il peut potentiellement permettre la découverte de la fonction d'un romangène dans la peau ou pour enquêter sur un nouveau traitement pour les maladies cutanées.

Introduction

La peau est la première ligne de défense de l'hôte. Kératinocvtes (KCS) sont le principal type de cellules dans la peau des humains et des souris. En réponse à des stimuli de l' environnement (par exemple la lumière du soleil, de l' oxygène, les produits chimiques et l' invasion pathogène), KCs sont activés et produisent une grande variété de cytokines et de chimiokines pro - inflammatoires telles que l' IL-8, IL-6, IL-1α, IL-1β, TNF - a α et GM-CSF ^1. Ensemble, ils déclenchent le recrutement de cellules immunitaires de la peau. Aggravé l' inflammation cutanée est souvent associée à de nombreuses maladies humai....

Protocole

Des souris femelles à 8 - 12 semaines ont été utilisés pour cette étude. C57 / BL6 de type sauvage (WT) et l' IL-15 déficiente (IL15 ^{- / -)} souris ont été achetés auprès de Centre national des animaux de laboratoire (NLAC), Taiwan et Taconic Farm, respectivement. IL-15 déficient (IL15 - / -) et de l' IL-15-dominant (+/- IL15 et l' IL15 + / +) ont montré un rapport 1: 3 dans la deuxième génération de la croix des hétérozygotes de IL15. Le génotype de IL15 - / - souris a été confirmée par une analyse par PCR. Les souris ont été maintenues dans l'installation spécifique exempt d'organis....

Résultats

Alors que quelques rougeurs était évidente dans la première heure après avec des aiguilles d' une piqûre acupuncture, la peau éclaircit le jour 2 et aucune réaction cutanée indésirable jusqu'au jour 7 a été observée après repiquage (figure 2A). Picotement de l' aiguille induit très faible niveau de orthokératosiques épidermique et infiltration cutanée minimale par l' analyse H & E par rapport à la peau non traitée (fi.......

Discussion

L'étape la plus critique pour assurer l'expression de l'ADN de plasmide est acufected à osciller de manière uniforme et desserrer la couche cornée de la peau. Tout en poussant les aiguilles doucement sans couper la peau, la force devrait être assez dur pour appuyer sur la surface. Afin de faciliter l'absorption de l'ADN dans une solution de 10 ul sur un 1 cm x surface de 1 cm, les aiguilles doivent osciller vers le haut et vers le bas pour environ 100 fois dans les 30 s. On peut déterminer la force q.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Accu Handy Needle	Accu	36Gx0.5	Dispositif médical
NairTM Lotion	Church & Dwight	N/A	Utilisation pour épiler
Shandon Xyline substitut	Thermo Fisher Scientific	6764506	Déparaffinisation
Avertin (2,2,2-Tribromethanol)	Sigma-Aldrich	T4,840-2	Anesthésie
2-méthyl-2-butanol	Sigma-Aldrich	152463	Solvant pour la dissolution de l’avertin
DifcoTM LB bouillon, Miller	BD	244620	Propagation et entretien de E. coli pour la biologie moléculaire
Souris IL-15/IL-15R Complex ELISA Ready-SET-Go kit	eBioscience	88-7215	Measure IL-15
protein Anti-mouse Ly6G	BioLegend	127601	Anticorps utilisé pour la coloration immunohistochimique
anti-souris Ki-67	eBioscience	14-5698-80	Anticorps utilisé pour coloration immunohistochimique
Souris à coloration simple MAXPO (Rat)	Nichirei Biosciences	414341F	Réactif pour bloquer le signal de fond dans une coloration souris sur souris
Kit de substrat de peroxydase DAB (HRP) Vector	Laboratories	SK-4100	Substrat de peroxydse pour coloration immunohistochimique
Bloc Ultra V Thermo	Fisher Scientific	TA-060-UB	Réduire la coloration de fond non spécifique
Vert de méthyle	Sigma-Aldrich	M8884	Coloration nucléaire
Vecta MountTM	Vector Laboratories	M-5000	Préservation permanente des colorants histochimiques
Inhibiteurs de protéase Cocktails de comprimés	Roche	04-693-116-001	Inhibition de l’activité de la protéase dans le lysat cellulaire
Crème Aldara	3M Parmaceuticals	N/A	5 % imiquimod
Bessman Tissue Pulverizer	Spectrum Labs	189475	Utilisation pour pulvériser les tissus cutanés
ABI7900HT cycler	Thermo Fisher Scientific	N/A	quantitatif par PCR en temps réel
Caméscope	Panasonic	HDC-SD60	Documentation d’image
Axio Scope.A1	ZEISS	N/A	Microscopie à fond clair

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