إعداد ومراقبة العينات البيولوجية سميكة من قبل الضوئي نقل الإلكترون التصوير المقطعي
Summary
This report describes a sample preparation protocol and specific imaging conditions for performing scanning transmission electron tomography of thick biological specimens.
Abstract
This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It also describes an imaging method for studying the 3D structure of thick biological specimens by scanning transmission electron tomography. The sample preparation protocol is based on conventional methods in which the sample is fixed using chemical agents, treated with a heavy atom salt contrasting agent, dehydrated in a series of ethanol baths, and embedded in resin. The specific imaging conditions for observing thick samples by scanning transmission electron microscopy are then described. Sections of the sample are observed using a through-focus method involving the collection of several images at various focal planes. This enables the recovery of in-focus information at various heights throughout the sample. This particular collection pattern is performed at each tilt angle during tomography data collection. A single image is then generated, merging the in-focus information from all the different focal planes. A classic tilt-series dataset is then generated. The advantage of the method is that the tilt-series alignment and reconstruction can be performed using standard tools. The collection of through-focal images allows the reconstruction of a 3D volume that contains all of the structural details of the sample in focus.
Introduction
منذ أوائل 1970s، يقترب التصوير المقطعي في انتقال المجهر الإلكتروني (تيم) وقد استخدمت على نطاق واسع لتوصيف الهيكلي من العينات البيولوجية 1، 2، 3. كان النداء من التصوير المقطعي الإلكترون أنها يمكن أن تستخدم لدراسة مجموعة واسعة من الهياكل البيولوجية على مقياس متناهي الصغر، من بنية الخلايا والتركيب الدقيق للعضيات لهيكل المجمعات الجزيئات والبروتينات. ومع ذلك، لا يمكن استخدام التصوير المقطعي الإلكترون لدراسة عينات سميكة جدا (أكبر من 0.5 ميكرون). في الواقع، عينات سميكة تنتج الكثير من الإلكترونات المبعثرة، وتوليد منخفضة نسبة الإشارة إلى الضوضاء (SNR) وصور. وبالإضافة إلى ذلك، التصوير المقطعي ينطوي على مجموعة من الصور من العينات يميل، مع سماكة واضح من العينة زيادة مع زاوية الميل. على الرغم من نثر غير مرن يمكن أن تتم تصفيتهخارج باستخدام مرشحات الطاقة، يتم الوصول إلى كمية حرجة من الإلكترونات اللازم للصور SNR عالية بالكاد في تيم. وبالتالي، يكون فقط تم دراسة العينات البيولوجية سميكة باستخدام باجتزاء 4.
بعض العينات لا يمكن أن شرائح: البعض قد تتحلل عندما يتم قطع، والبعض الآخر بحاجة إلى أن تدرس في مجملها من أجل فهم تعقيداتها. نهج بديل هو استخدام تيم في وضع 5، 6، 7، 8 المسح الضوئي. في المجهر الإلكتروني النافذ (STEM)، مسار بصري من الإلكترونات وهو يختلف عن ذلك في TEM التقليدية. الالكترونات التي تمر عبر عينة من دون تشتت يمكن جمعها على المحور البصري مع مشرق الميدان (BF) كاشف 9، في حين أن تلك المنتشرة مطاطيا يمكن جمعها في زاوية معينة من المحور البصري مع كاشف الظلام الميدان (DF).ميزة أخرى من STEM هي أن شعاع الالكترون تركيزا يتم فحصه على سطح العينة، مما يساعد على جمع بكسل حسب بكسل للصور. على الرغم من أن شعاع الالكترون يوسع بينما يمر من خلال العينة 10، هذا المخطط مجموعة معينة هو أقل حساسية للإلكترونات المنتشرة inelastically من تيم التقليدية. وعلاوة على ذلك، ليس هناك عدسة بعد العينة في STEM، وبالتالي تجنب الانحرافات اللونية التي يمكن أن تحدث في تيم. طول الكاميرا يمكن تعديلها بحيث كاشف BF بالكشف أساسا الإلكترونات unscattered. باستخدام كاشف DF لدراسة عينات سميكة لا ينصح به بسبب تشتت متعددة، والتي تنتج صورا دقيقة. بدلا من ذلك، كشف BF يمكن استخدام 11. في حين الجذعية يمكن أن تنتج صورا SNR عالية، ولديها منخفض نسبيا العمق من الميدان نظرا للتقارب شعاع عالية نسبيا مقارنة مع تيم، والحد من كمية المعلومات المتعمقة التي يمكن استردادها من سميكةالعينات. في حالة المجهر STEM لتصحيح انحراف، حيث زاوية التقارب يمكن أن تصل إلى 30 مراد، يمكن مجال العمق من تكون منخفضة بما فيه الكفاية بحيث تنبع المعلومات التي هي في التركيز من طائرة الوصل فقط بضعة نانوميتر . إنشاء شعاع الالكترون في وضع مواز يعزز العمق من مجال شعاع الالكترون على حساب القرار 12. ومع ذلك، هذا الإعداد ليس من الممكن دائما.
كلما كان ذلك ضروريا لاستخدام شعاع متقاربة الإلكترون، لا بد من استخدام التقنيات التي تعزز العمق من مجال شعاع الالكترون عند دراسة عينات سميكة. وأفادت الدراسات الأخيرة اقتناء صور متعددة في طائرات التنسيق المختلفة في جميع أنحاء عينة لاسترداد أكبر قدر ممكن من المعلومات في التركيز 13 و 14. تصف الدراسات طريقتين مختلفتين للتعامل مع المعلومات من طائرات التنسيق المختلفة. Hovden وآخرون.الجمع في الفضاء فورييه الصور التي تم جمعها في طائرات التنسيق المختلفة، والحصول على إعادة الإعمار النهائي مباشرة من معكوس 3D تحويل فورييه 13. في المقابل، DAHMEN وآخرون. وضع محرك شعاع اعادة الاعمار متقاربة لإعادة بناء في الفضاء الحقيقي حجم 3D من طائرات التنسيق المختلفة 14. وضعت لدينا مختبر أيضا وسيلة لتصوير العينات البيولوجية سميكة. كانت استراتيجيتنا مختلفة من طريقتين المذكورة أعلاه في أننا دمج المعلومات التي هي في التركيز في طائرات التنسيق المختلفة وإعادة بنائها حجم 3D النهائي في الفضاء الحقيقي باستخدام شعاع ضوئي مواز 15. كان هدفنا هو تطوير طريقة التي يمكن أن تتم في أي مختبر المجهر الإلكتروني. تحقيقا لهذه الغاية، ونحن تهدف إلى جمع الصور محورية في كمية محدودة من الوقت، مقارنة الإطار الزمني للتجارب التصوير المقطعي التقليدية. وبالإضافة إلى ذلك، لدينا اقتراح طريقة جولد تكييفها للاستخدام مع أنواع مختلفة من التنسيق والبرمجيات إعادة الإعمار.
في سياق النشر لدينا من 2015 15، أردنا أن تصور وتميز الانتعاش من العمق من الميدان، لذلك استخدمنا تقارب كبير شبه زاوية من 25 مراد. هنا، نقدم بروتوكول خطوة بخطوة لأداء من خلال-تنسيق التصوير في STEM وفقا لطريقة تم تطويرها في المختبر لدينا في عام 2015 15، ونقدم كيف تمت معالجة البيانات من 2015. هذه الطريقة استرداد المعلومات في التركيز من عدة طائرات التنسيق في جميع أنحاء (750 نانومتر) عينة بيولوجية سميكة ويمكن اعادة البناء 3D عالية الجودة. حيثما كان ذلك مناسبا، وتعرض أيضا الاختلافات في هذه المنهجية مقابل الأساليب التي تستخدمها الجماعات الأخرى.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذه المقالة، نقدم بروتوكول إعداد نموذج التقليدية جنبا إلى جنب مع دليل خطوة بخطوة لإجراء تحليل 3D على العينات البيولوجية سميكة باستخدام STEM من خلال البؤرية التصوير المقطعي. وقد تم استخدام الراتنج التضمين من العينات البيولوجية لعقود 26، والبروتوكولات ال…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by two ANR grants (ANR-11-BSV8-016 and ANR-10-IDEX-0001-02). We also acknowledge the PICT-IBiSA for providing access to chemical imaging equipment.
Materials
| Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 2860 | |
| Epoxy resin | EMS | 14120 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Add paraformaldehyde powder to PBS heated at approximately 60 °C. Increase pH by adding 1 N NaOH until no PFA powder is visible. |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| Osmium Tetroxyde | EMS | 19150 | |
| Uranyl Acetate | Sigma-Aldrich | 73943 | |
| Gelatin Capsule | EMS | 70110 | |
| Triming and Histo knives | LFG Distribution | Diatome diamond knives | |
| Electron Microscopy copper grid | LFG Distribution | G200-Cu | |
| Grid Coating Pen | LFG Distribution | 70624 | |
| Specimen Holder | JEOL | EM-21311 HTR | |
| Electron Microscope | JEOL | JEM-2200FS |
References
- De Rosier, D. J., Klug, A. Reconstruction of three dimensional structures from electron micrographs. Nature. 217 (5124), 130-134 (1968).
- Gan, L., Jensen, G. J. Electron tomography of cells. Q Rev Biophys. 45 (1), 27-56 (2012).
- Lucic, V., Rigort, A., Baumeister, W. Cryo-electron tomography: the challenge of doing structural biology in situ. J Cell Biol. 202 (3), 407-419 (2013).
- Al-Amoudi, A., et al. Cryo-electron microscopy of vitreous sections. EMBO J. 23 (18), 3583-3588 (2004).
- Koguchi, M., et al. Three-dimensional STEM for observing nanostructures. J Electron Microsc (Tokyo). 50 (3), 235-241 (2001).
- Midgley, P. A., Weyland, M. 3D electron microscopy in the physical sciences: the development of Z-contrast and EFTEM tomography. Ultramicroscopy. 96 (3-4), 413-431 (2003).
- Sousa, A. A., Azari, A. A., Zhang, G., Leapman, R. D. Dual-axis electron tomography of biological specimens: Extending the limits of specimen thickness with bright-field STEM imaging. J Struct Biol. 174 (1), 107-114 (2011).
- Sousa, A. A., Leapman, R. D. Development and application of STEM for the biological sciences. Ultramicroscopy. , 38-49 (2012).
- Ercius, P., Muller, D. Incoherent bright field STEM for imaging and tomography of ultra-thick TEM cross-sections. Microsc Microanal. 15, (2009).
- Hyun, J. K., Ercius, P., Muller, D. A. Beam spreading and spatial resolution in thick organic specimens. Ultramicroscopy. 109 (1), 1-7 (2008).
- Aoyama, K., Takagi, T., Hirase, A., Miyazawa, A. STEM tomography for thick biological specimens. Ultramicroscopy. 109 (1), 70-80 (2008).
- Biskupek, J., Leschner, J., Walther, P., Kaiser, U. Optimization of STEM tomography acquisition–a comparison of convergent beam and parallel beam STEM tomography. Ultramicroscopy. 110 (9), 1231-1237 (2010).
- Hovden, R., et al. Breaking the Crowther limit: combining depth-sectioning and tilt tomography for high-resolution, wide-field 3D reconstructions. Ultramicroscopy. 140, 26-31 (2014).
- Dahmen, T., et al. Combined scanning transmission electron microscopy tilt- and focal series. Microsc Microanal. 20 (2), 548-560 (2014).
- Trepout, S., Messaoudi, C., Perrot, S., Bastin, P., Marco, S. Scanning transmission electron microscopy through-focal tilt-series on biological specimens. Micron. 77, 9-15 (2015).
- Weyland, M., Muller, D. A. Tuning the convergence angle for optimum STEM performance. FEI Nanosolutions. 1 (24), (2005).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Trans Image Process. 7 (1), 27-41 (1998).
- Forster, B., Van De Ville, D., Berent, J., Sage, D., Unser, M. Complex wavelets for extended depth-of-field: a new method for the fusion of multichannel microscopy images. Microsc Res Tech. 65 (1-2), 33-42 (2004).
- Messaoudii, C., Boudier, T., Sanchez Sorzano, ., O, C., Marco, S. TomoJ: tomography software for three-dimensional reconstruction in transmission electron microscopy. BMC Bioinformatics. 8, 288 (2007).
- Sorzano, C. O., et al. Marker-free image registration of electron tomography tilt-series. BMC Bioinformatics. 10, 124 (2009).
- Kohl, L., Bastin, P. The flagellum of trypanosomes. Int Rev Cytol. 244, 227-285 (2005).
- Luft, J. H. Improvements in epoxy resin embedding methods. J Biophys Biochem Cytol. 9, 409-414 (1961).
- Mielanczyk, L., Matysiak, N., Michalski, M., Buldak, R., Wojnicz, R. Closer to the native state. Critical evaluation of cryo-techniques for Transmission Electron Microscopy: preparation of biological samples. Folia Histochem Cytobiol. 52 (1), 1-17 (2014).
- Hovden, R., Xin, H. L., Muller, D. A. Extended depth of field for high-resolution scanning transmission electron microscopy. Microsc Microanal. 17 (1), 75-80 (2011).
- Dahmen, T., et al. The Ettention software package. Ultramicroscopy. 161, 110-118 (2016).
- Murata, K., et al. Whole-cell imaging of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae by high-voltage scanning transmission electron tomography. Ultramicroscopy. 146, 39-45 (2014).
- Kizilyaprak, C., Daraspe, J., Humbel, B. M. Focused ion beam scanning electron microscopy in biology. J Microsc. 254 (3), 109-114 (2014).
- Kubota, Y. New developments in electron microscopy for serial image acquisition of neuronal profiles. Microscopy (Oxf). 64 (1), 27-36 (2015).
- Levin, B. D., et al. Nanomaterial datasets to advance tomography in scanning transmission electron microscopy. Sci Data. 3, 160041 (2016).
