Vorbereitung und Beobachtung von Dick biologischen Proben durch Scanning Transmission Electron Tomography

Summary

This report describes a sample preparation protocol and specific imaging conditions for performing scanning transmission electron tomography of thick biological specimens.

Abstract

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It also describes an imaging method for studying the 3D structure of thick biological specimens by scanning transmission electron tomography. The sample preparation protocol is based on conventional methods in which the sample is fixed using chemical agents, treated with a heavy atom salt contrasting agent, dehydrated in a series of ethanol baths, and embedded in resin. The specific imaging conditions for observing thick samples by scanning transmission electron microscopy are then described. Sections of the sample are observed using a through-focus method involving the collection of several images at various focal planes. This enables the recovery of in-focus information at various heights throughout the sample. This particular collection pattern is performed at each tilt angle during tomography data collection. A single image is then generated, merging the in-focus information from all the different focal planes. A classic tilt-series dataset is then generated. The advantage of the method is that the tilt-series alignment and reconstruction can be performed using standard tools. The collection of through-focal images allows the reconstruction of a 3D volume that contains all of the structural details of the sample in focus.

Introduction

Seit den frühen 1970er Jahren, Ansätze Tomographie in der Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) wurden weitgehend für die strukturelle Charakterisierung von biologischen Proben ^{1, 2, 3} verwendet. Die Anziehungskraft des Transmissionselektronentomographie war, dass es verwendet werden könnte, ein breites Spektrum von biologischen Strukturen im Nanometerbereich zu studieren, von der Architektur der Zellen und die Ultrastruktur von Organellen zu der Struktur von makromolekularen Komplexen und Proteinen. Dennoch könnte Transmissions-Elektronen-Tomographie nicht zu studieren, sehr dicke Proben verwendet werden (mehr als 0,5 & mgr; m). Tatsächlich produzieren dicke Proben zu viele gestreute Elektronen zu erzeugen niedrigen Signal-zu-Rausch-Verhältnis (SNR) Bilder. Darüber hinaus beinhaltet die Tomographie Sammlung von Bildern von gekippten Proben, mit der scheinbaren Dicke der Probe mit der Neigungswinkel erhöht wird. Obwohl kann die unelastische Streuung gefiltert werdenEnergiefilter geführt, wobei die kritische Menge an Elektronen für hohe SNR Bilder benötigt wird, kaum in TEM erreicht. Daher haben dicke biologische Proben nur untersucht worden sectioning ⁴ verwendet wird .

Einige Proben können nicht geschnitten werden: einige verschlechtern könnten, wenn sie geschnitten werden, und andere müssen in ihrer Gesamtheit untersucht, um zu ihrer Komplexität zu verstehen. Ein alternativer Ansatz ist die Verwendung TEM in Abtastmodus ^{5, 6, 7, 8.} In Rastertransmissions-Elektronenmikroskopie (STEM), die optische Weglänge der Elektronen unterscheidet sich von dem in konventionellen TEM. Elektronen durch die Probe ohne Streuung hindurchtritt, mit einem Hellfeld- (BF) Detektor ^9, während die gestreute elastisch in einem bestimmten Winkel von der optischen Achse mit einem Dunkelfeld (DF) -Detektor gesammelt auf der optischen Achse gesammelt werden kann.Der andere Vorteil der STEM ist, daß der fokussierte Elektronenstrahl an der Oberfläche der Probe abgetastet wird, wodurch die Pixel-für-Pixel-Sammlung der Bilder. Auch wenn der Elektronenstrahl während verbreitert ¹⁰ durch die Probe vorbei, diese besondere Sammelsystem ist weniger anfällig für unelastisch gestreute Elektronen als herkömmliche TEM. Darüber hinaus gibt es keine Linse post-Probe in STEM, wodurch die chromatischen Aberrationen zu vermeiden, die in TEM auftreten können. Die Kameralänge kann eingestellt werden, so daß der Detektor hauptsächlich BF ungestreute Elektronen detektiert. Mit dem DF-Detektor dicken Proben zu studieren ist nicht wegen der Mehrfachstreuung empfohlen, die ungenaue Bilder erzeugt. Stattdessen kann der BF – Detektor ¹¹ verwendet werden. Während STEM hohe SNR Bilder erzeugen kann, hat es eine relativ geringe Schärfentiefe-Bereich aufgrund des relativ hohen Strahlkonvergenz im Vergleich zu TEM, die Menge der eingehenden Informationen abnimmt, die von dicken wiederhergestellt werden könnenProben. Im Falle von fehlerkorrigierten STEM Mikroskope, wo der Konvergenzwinkel so hoch wie 30 mrad sein kann, kann die Tiefe des Feldes niedrig genug sein, so dass die Informationen, die in Fokus von einer Brennebene stammt von nur wenigen Nanometern . Einstellen des Elektronenstrahls im Parallelbetrieb bis erhöht die Schärfentiefe-Bereich des Elektronenstrahls zu Lasten der Auflösung ^12. Allerdings ist diese Einstellung nicht immer möglich.

Wann immer es notwendig ist, einen konvergenten Elektronenstrahl zu verwenden, muss man Techniken verwenden, die die Tiefe der Bereich des Elektronenstrahls erhöhen, wenn dicke Proben zu studieren. Jüngste Studien haben die Übernahme von mehreren Bildern an verschiedenen Fokusebenen in der gesamten Probe angegeben in-focus die maximale Menge an Informationen wiederherzustellen ^{13, 14.} Die beiden Studien beschreiben verschiedene Möglichkeiten, um die Informationen aus den verschiedenen Fokusebenen zu behandeln. Hovden et al.im Fourierraum kombiniert , um die Bilder , die bei verschiedenen Brennebenen gesammelt wurden, und die endgültige Rekonstruktion wurde direkt aus dem 3D inverse Fourier – Transformation ¹³ erhalten. Im Gegensatz dazu Dahmen et al. eine konvergente Strahlrekonstruktionsmaschine entwickelt , um das 3D – Volumen aus den verschiedenen Brennebenen ¹⁴ im realen Raum zu rekonstruieren. Unser Labor entwickelt auch ein Verfahren zur Abbildung dicken biologischen Proben. Unsere Strategie war anders als die beiden oben beschriebenen Verfahren, dass wir die Informationen zusammengefasst , die in den verschiedenen Brennebenen fokussiert ist und rekonstruiert die endgültige 3D – Volumen im realen Raum einen parallelen Strahl Projektor ¹⁵ verwendet wird . Unser Ziel war es, ein Verfahren zu entwickeln, die leicht in jeder Elektronenmikroskopie Labor durchgeführt werden kann. Zu diesem Zweck war es unser Ziel, die Brenn Bilder in einer begrenzten Zeit, vergleichbar mit dem Zeitrahmen von herkömmlichen Tomographie Experimenten zu sammeln. Darüber hinaus ist unsere vorgeschlagene Verfahren could für die Verwendung mit verschiedenen Arten von Ausrichtung und Rekonstruktionssoftware angepasst werden.

Im Rahmen unserer Veröffentlichung ab dem Jahr 2015 ^15, wollten wir die Erholung der depth-of-field zu visualisieren und zu charakterisieren, so haben wir eine große Konvergenz Halbwinkel von 25 mrad. Hier präsentieren wir eine Schritt- für -Schritt – Protokoll zur Durchführung einer Durchbrenn Bildgebung in STEM nach der Methode entwickelt in unserem Labor im Jahr 2015 ^15, und wir präsentieren , wie die Daten von 2015 verarbeitet wurde. Diese Methode erholt sich im Fokus befindlichen Informationen aus mehreren Fokusebenen über einen dicken (750 nm) biologischen Probe und ermöglicht qualitativ hochwertige 3D-Rekonstruktionen. Gegebenenfalls sind die Unterschiede in dieser Methodik im Vergleich zu den Methoden, die von anderen Gruppen verwendet werden ebenfalls vorgestellt.

Protocol

Achtung: Konsultieren Sie die Sicherheitsdatenblätter (MSDS) der verschiedenen Reagenzien vor der Verwendung. Einige der Chemikalien bei der Probenvorbereitung verwendet werden, sind giftig, krebserregend, erbgutverändernd und / oder fortpflanzungsgefährdende. Persönliche Schutzausrüstung (Handschuhe, Kittel, in voller Länge Hosen und geschlossene Schuhe) und arbeiten unter einem Abzug, während die Probe Handhabung. Sectioning der Probe mit einem Ultramikrotom beinhaltet die Verwendung von scharfen Instrumenten, …

Representative Results

In unserer Studie wurden die Elektronen 200 kV in der Feldemissionskanone Transmissionselektronenmikroskop beschleunigt. Die Bilder wurden in MINT-BF-Modus unter Verwendung eines 20-us Verweilzeit gesammelt. In Bezug auf die Gestaltung der Durchbrenn Tilt-Serie, fanden wir, dass der Fokus Abstand von 150 nm für die ultrastrukturelle Untersuchung einer 750 nm dicken biologischen Probe-obwohl die Tiefe der Bereich des Elektronenstrahls nur befriedigende Ergebnisse gab, war 3 nm-da wir ein…

Discussion

In diesem Artikel stellen wir eine konventionelle Probenvorbereitungsprotokoll zusammen mit einem Schritt-für-Schritt-Anleitung für die 3D-Analyse auf dicken biologischen Proben durchführen STEM durchBrennTomographie. Harz Einbettung von biologischen Proben ist seit Jahrzehnten ²⁶ und alternative Protokolle verwendet, die auf unterschiedliche Arten von Proben geeignet sind , können in der gesamten ²⁷ – Literatur gefunden werden. Im Gegensatz dazu Bildgebung dicken Prob…

Materials

Phosphate Buffered Saline	Sigma-Aldrich	P4417
Ethanol	Sigma-Aldrich	2860
Epoxy resin	EMS	14120
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	Add paraformaldehyde powder to PBS heated at approximately 60 °C. Increase pH by adding 1 N NaOH until no PFA powder is visible.
Glutaraldehyde	Sigma-Aldrich	G5882
Osmium Tetroxyde	EMS	19150
Uranyl Acetate	Sigma-Aldrich	73943
Gelatin Capsule	EMS	70110
Triming and Histo knives	LFG Distribution	Diatome diamond knives
Electron Microscopy copper grid	LFG Distribution	G200-Cu
Grid Coating Pen	LFG Distribution	70624
Specimen Holder	JEOL	EM-21311 HTR
Electron Microscope	JEOL	JEM-2200FS