Подготовка и наблюдение Толстые биологических образцов с помощью сканирующего трансмиссионной электронной томографии
Summary
This report describes a sample preparation protocol and specific imaging conditions for performing scanning transmission electron tomography of thick biological specimens.
Abstract
This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It also describes an imaging method for studying the 3D structure of thick biological specimens by scanning transmission electron tomography. The sample preparation protocol is based on conventional methods in which the sample is fixed using chemical agents, treated with a heavy atom salt contrasting agent, dehydrated in a series of ethanol baths, and embedded in resin. The specific imaging conditions for observing thick samples by scanning transmission electron microscopy are then described. Sections of the sample are observed using a through-focus method involving the collection of several images at various focal planes. This enables the recovery of in-focus information at various heights throughout the sample. This particular collection pattern is performed at each tilt angle during tomography data collection. A single image is then generated, merging the in-focus information from all the different focal planes. A classic tilt-series dataset is then generated. The advantage of the method is that the tilt-series alignment and reconstruction can be performed using standard tools. The collection of through-focal images allows the reconstruction of a 3D volume that contains all of the structural details of the sample in focus.
Introduction
С начала 1970 – х годов, томографию подходы в просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) широко используется для структурной характеристики биологических образцов 1, 2, 3. Привлекательность просвечивающей электронной томографии в том, что он может быть использован для изучения широкого спектра биологических структур в нанометровом масштабе, от архитектуры клеток и ультраструктуры органелл к структуре макромолекулярных комплексов и белков. Тем не менее, просвечивающая электронная томография не может быть использован для изучения очень толстых образцов (более 0,5 мкм). Действительно, толстые образцы производят слишком много рассеянных электронов, создавая низкое отношение сигнал-шум (SNR) изображения. Кроме того, томография включает в себя сбор образов наклоненных образцов, с видимой толщиной образца с увеличением угла наклона. Несмотря на то, неупругое рассеяние может быть отфильтрованс использованием энергетических фильтров, критическое количество электронов, необходимых для высоких SNR изображений едва достигал в ПЭМ. Следовательно, толстые биологические образцы только были изучены с помощью секционирования 4.
Некоторые образцы не могут быть нарезаны: некоторые из них могут ухудшиться, если они отрезаны, а другие должны быть изучены во всей их полноте, чтобы понять их сложность. Альтернативный подход заключается в использовании ПЭМ в режиме 5, 6, 7, 8 сканирования. В сканирующей просвечивающей электронной микроскопии (STEM), оптический путь электронов отличается от таковой в обычных ТЭМ. Электроны , проходя через образец без рассеяния могут быть собраны на оптической оси с детектором 9 светлого поля (BF), в то время как те упругое рассеяние может быть собрана под определенным углом от оптической оси с детектором темного поля (DF).Другим преимуществом является то, что STEM сфокусированный электронный пучок сканируется на поверхности образца, что позволяет коллекции элемент за пикселем изображения. Даже при том , что электронный луч расширяется при прохождении через образец 10, эта конкретная схема сбора менее чувствительна к неупругорассеянных электронов по сравнению с обычными ТЭМ. Кроме того, нет линзы после образца в STEM, что позволяет избежать хроматических аберраций, которые могут возникнуть в ПЭМ. Длина камеры может быть отрегулирован таким образом, чтобы детектор БФ главным образом обнаруживает нерассеянный электроны. Использование детектора DF для изучения толстых образцов не рекомендуется из-за многократного рассеяния, которое производит неточные изображения. Вместо того, чтобы детектор BF может быть использован 11. В то время как STEM может произвести высокое SNR изображения, он имеет относительно низкую глубину резкости из-за относительно высокой сходимости пучка по сравнению с ТЕМ, уменьшением количества информации, содержащейся в углубленных, которая может быть извлечена из толстойобразцы. В случае аберраций скорректированной STEM микроскопах, где угол сходимости может достигать до 30 мрад, поле глубины может быть достаточно низкой, чтобы информация, которая находится в фокусе берет свое начало от фокальной плоскости лишь несколько нанометров , Настройка электронного пучка в параллельном режиме увеличивает глубину резкости электронного пучка в ущерб резолюции 12. Тем не менее, эта установка не всегда возможно.
Всякий раз, когда необходимо использовать сходящийся электронный пучок, необходимо использовать методы, которые увеличивают глубину резкости электронного пучка при изучении толстых образцов. Недавние исследования сообщили о приобретении нескольких изображений в различных фокальных плоскостях по всему образцу для восстановления максимального количества в фокусе информации 13, 14. Два исследования описывают различные способы обработки информации из различных фокальных плоскостях. Hovden и др.объединены в фурье – пространстве образы , которые были собраны в различных фокальных плоскостях, а окончательная реконструкция была получена непосредственно из 3D – обратное преобразование Фурье 13. В противоположность этому , Dahmen и др. разработал сходящийся двигатель реконструкции пучка для реконструкции в реальном пространстве 3D – объем от различных координационных плоскостей 14. Наша лаборатория также разработала метод визуализации толстых биологических образцов. Наша стратегия отличается от двух методов , описанных выше , в том , что мы объединили информацию , которая находится в фокусе в различных фокальных плоскостях и реконструировано конечный объем 3D в реальном пространстве с помощью параллельного луча проектора 15. Наша цель состояла в том, чтобы разработать метод, который может быть легко осуществлен в любой электронной микроскопии лаборатории. С этой целью мы стремились собрать фокусные изображения в ограниченном количестве времени, сопоставимого со сроками обычных экспериментов томографии. Кроме того, предложенный нами метод сульд быть адаптирован для использования с различными типами выравнивания и программного обеспечения восстановления.
В контексте нашей публикации с 2015 15, мы хотели , чтобы визуализировать и охарактеризовать восстановление глубины резкости, таким образом , мы использовали большой сходимости полу-угол 25 мрад. Здесь мы приводим протокол шаг за шагом для выполнения сквозного фокусного изображения в STEM в соответствии с методикой , разработанной в нашей лаборатории в 2015 году 15, и мы представляем , как были обработаны данные с 2015 года. Этот метод восстанавливает в фокусе информацию от нескольких координационных плоскостей по всей толстой (750 нм) биологического образца и обеспечивает высокое качество 3D-реконструкций. Там, где это уместно, различия в этой методологии по сравнению с методами, используемыми другими группами, также представлены.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этой статье мы представляем традиционный протокол подготовки образца вместе с руководством шаг за шагом для выполнения 3D-анализа на толстых биологических образцов с использованием STEM через очаговых томографии. Смола вложение биологических образцов был использован в течение десят?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by two ANR grants (ANR-11-BSV8-016 and ANR-10-IDEX-0001-02). We also acknowledge the PICT-IBiSA for providing access to chemical imaging equipment.
Materials
| Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 2860 | |
| Epoxy resin | EMS | 14120 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Add paraformaldehyde powder to PBS heated at approximately 60 °C. Increase pH by adding 1 N NaOH until no PFA powder is visible. |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| Osmium Tetroxyde | EMS | 19150 | |
| Uranyl Acetate | Sigma-Aldrich | 73943 | |
| Gelatin Capsule | EMS | 70110 | |
| Triming and Histo knives | LFG Distribution | Diatome diamond knives | |
| Electron Microscopy copper grid | LFG Distribution | G200-Cu | |
| Grid Coating Pen | LFG Distribution | 70624 | |
| Specimen Holder | JEOL | EM-21311 HTR | |
| Electron Microscope | JEOL | JEM-2200FS |
References
- De Rosier, D. J., Klug, A. Reconstruction of three dimensional structures from electron micrographs. Nature. 217 (5124), 130-134 (1968).
- Gan, L., Jensen, G. J. Electron tomography of cells. Q Rev Biophys. 45 (1), 27-56 (2012).
- Lucic, V., Rigort, A., Baumeister, W. Cryo-electron tomography: the challenge of doing structural biology in situ. J Cell Biol. 202 (3), 407-419 (2013).
- Al-Amoudi, A., et al. Cryo-electron microscopy of vitreous sections. EMBO J. 23 (18), 3583-3588 (2004).
- Koguchi, M., et al. Three-dimensional STEM for observing nanostructures. J Electron Microsc (Tokyo). 50 (3), 235-241 (2001).
- Midgley, P. A., Weyland, M. 3D electron microscopy in the physical sciences: the development of Z-contrast and EFTEM tomography. Ultramicroscopy. 96 (3-4), 413-431 (2003).
- Sousa, A. A., Azari, A. A., Zhang, G., Leapman, R. D. Dual-axis electron tomography of biological specimens: Extending the limits of specimen thickness with bright-field STEM imaging. J Struct Biol. 174 (1), 107-114 (2011).
- Sousa, A. A., Leapman, R. D. Development and application of STEM for the biological sciences. Ultramicroscopy. , 38-49 (2012).
- Ercius, P., Muller, D. Incoherent bright field STEM for imaging and tomography of ultra-thick TEM cross-sections. Microsc Microanal. 15, (2009).
- Hyun, J. K., Ercius, P., Muller, D. A. Beam spreading and spatial resolution in thick organic specimens. Ultramicroscopy. 109 (1), 1-7 (2008).
- Aoyama, K., Takagi, T., Hirase, A., Miyazawa, A. STEM tomography for thick biological specimens. Ultramicroscopy. 109 (1), 70-80 (2008).
- Biskupek, J., Leschner, J., Walther, P., Kaiser, U. Optimization of STEM tomography acquisition–a comparison of convergent beam and parallel beam STEM tomography. Ultramicroscopy. 110 (9), 1231-1237 (2010).
- Hovden, R., et al. Breaking the Crowther limit: combining depth-sectioning and tilt tomography for high-resolution, wide-field 3D reconstructions. Ultramicroscopy. 140, 26-31 (2014).
- Dahmen, T., et al. Combined scanning transmission electron microscopy tilt- and focal series. Microsc Microanal. 20 (2), 548-560 (2014).
- Trepout, S., Messaoudi, C., Perrot, S., Bastin, P., Marco, S. Scanning transmission electron microscopy through-focal tilt-series on biological specimens. Micron. 77, 9-15 (2015).
- Weyland, M., Muller, D. A. Tuning the convergence angle for optimum STEM performance. FEI Nanosolutions. 1 (24), (2005).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Trans Image Process. 7 (1), 27-41 (1998).
- Forster, B., Van De Ville, D., Berent, J., Sage, D., Unser, M. Complex wavelets for extended depth-of-field: a new method for the fusion of multichannel microscopy images. Microsc Res Tech. 65 (1-2), 33-42 (2004).
- Messaoudii, C., Boudier, T., Sanchez Sorzano, ., O, C., Marco, S. TomoJ: tomography software for three-dimensional reconstruction in transmission electron microscopy. BMC Bioinformatics. 8, 288 (2007).
- Sorzano, C. O., et al. Marker-free image registration of electron tomography tilt-series. BMC Bioinformatics. 10, 124 (2009).
- Kohl, L., Bastin, P. The flagellum of trypanosomes. Int Rev Cytol. 244, 227-285 (2005).
- Luft, J. H. Improvements in epoxy resin embedding methods. J Biophys Biochem Cytol. 9, 409-414 (1961).
- Mielanczyk, L., Matysiak, N., Michalski, M., Buldak, R., Wojnicz, R. Closer to the native state. Critical evaluation of cryo-techniques for Transmission Electron Microscopy: preparation of biological samples. Folia Histochem Cytobiol. 52 (1), 1-17 (2014).
- Hovden, R., Xin, H. L., Muller, D. A. Extended depth of field for high-resolution scanning transmission electron microscopy. Microsc Microanal. 17 (1), 75-80 (2011).
- Dahmen, T., et al. The Ettention software package. Ultramicroscopy. 161, 110-118 (2016).
- Murata, K., et al. Whole-cell imaging of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae by high-voltage scanning transmission electron tomography. Ultramicroscopy. 146, 39-45 (2014).
- Kizilyaprak, C., Daraspe, J., Humbel, B. M. Focused ion beam scanning electron microscopy in biology. J Microsc. 254 (3), 109-114 (2014).
- Kubota, Y. New developments in electron microscopy for serial image acquisition of neuronal profiles. Microscopy (Oxf). 64 (1), 27-36 (2015).
- Levin, B. D., et al. Nanomaterial datasets to advance tomography in scanning transmission electron microscopy. Sci Data. 3, 160041 (2016).
