Preparación y observación de muestras biológicas mediante el escaneo de grueso Electrónica de Transmisión de Positrones

Summary

This report describes a sample preparation protocol and specific imaging conditions for performing scanning transmission electron tomography of thick biological specimens.

Abstract

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It also describes an imaging method for studying the 3D structure of thick biological specimens by scanning transmission electron tomography. The sample preparation protocol is based on conventional methods in which the sample is fixed using chemical agents, treated with a heavy atom salt contrasting agent, dehydrated in a series of ethanol baths, and embedded in resin. The specific imaging conditions for observing thick samples by scanning transmission electron microscopy are then described. Sections of the sample are observed using a through-focus method involving the collection of several images at various focal planes. This enables the recovery of in-focus information at various heights throughout the sample. This particular collection pattern is performed at each tilt angle during tomography data collection. A single image is then generated, merging the in-focus information from all the different focal planes. A classic tilt-series dataset is then generated. The advantage of the method is that the tilt-series alignment and reconstruction can be performed using standard tools. The collection of through-focal images allows the reconstruction of a 3D volume that contains all of the structural details of the sample in focus.

Introduction

Desde principios de la década de 1970, la tomografía se acerca en la microscopía electrónica de transmisión (TEM) han sido ampliamente utilizados para la caracterización estructural de las muestras biológicas ^{1, 2, 3.} El atractivo de la tomografía electrónica de transmisión era que podría ser utilizado para estudiar una amplia gama de estructuras biológicas a escala nanométrica, de la arquitectura de las células y la ultraestructura de los orgánulos a la estructura de los complejos macromoleculares y proteínas. Sin embargo, la tomografía electrónica de transmisión no se podría utilizar para estudiar muestras muy gruesas (mayor de 0,5 m). De hecho, las muestras gruesas producen demasiados electrones dispersos, la generación de imágenes de baja relación señal-ruido (SNR). Además, la tomografía implica la colección de imágenes de especímenes inclinados, con el espesor aparente de la muestra aumenta con el ángulo de inclinación. A pesar de que la dispersión inelástica se puede filtrarutilizando filtros de energía, la cantidad crítica de electrones necesarios para imágenes de alto SNR apenas se alcanza en TEM. Por lo tanto, las muestras biológicas de espesor sólo se han estudiado utilizando seccionamiento ^4.

Algunas muestras no pueden ser cortadas: algunos pueden degradar cuando se cortan, y otros necesitan ser estudiados en su totalidad con el fin de comprender su complejidad. Un enfoque alternativo es utilizar TEM en el modo ^{5, 6, 7, 8} de exploración. En microscopía de barrido electrónico de transmisión (STEM), la trayectoria óptica de los electrones es diferente de la de TEM convencional. Los electrones pasan a través de la muestra sin dispersión se pueden recoger en el eje óptico con un detector de campo brillante (BF) ^9, mientras que dispersa elásticamente se pueden recoger en un cierto ángulo desde el eje óptico con un detector de campo oscuro (DF).La otra ventaja de STEM es que el haz de electrones enfocado es escaneado en la superficie de la muestra, lo que permite la colección de píxel por píxel de las imágenes. A pesar de que el haz de electrones se ensancha mientras pasa a través de la muestra ^10, este sistema de recogida es menos sensible a los electrones inelástica dispersos que TEM convencional. Además, no hay lente post-espécimen en STEM, evitando así las aberraciones cromáticas que pueden ocurrir en TEM. La longitud de la cámara se puede ajustar de manera que el detector detecta BF principalmente electrones dispersados. Utilizando el detector DF para estudiar muestras gruesas, no se recomienda debido a la dispersión múltiple, que produce imágenes imprecisas. En lugar de ello, el detector de BF se puede utilizar ^11. Mientras STEM puede producir imágenes de alta SNR, tiene una relativamente baja profundidad de campo debido a la relativamente alta convergencia de haz en comparación con TEM, disminuyendo la cantidad de información en profundidad que se puede recuperar a partir de espesorespecímenes. En el caso de microscopios de STEM de aberración corregida, en el que el ángulo de convergencia puede ser tan alta como 30 mrad, el campo de profundidad de puede ser lo suficientemente baja para que la información que está en el foco origina a partir de un plano focal de sólo unos pocos nanómetros . Configuración del haz de electrones en el modo paralelo aumenta la profundidad de campo del haz de electrones en detrimento de la resolución ^12. Sin embargo, esta disposición no siempre es posible.

Siempre que sea necesario el uso de un haz de electrones convergente, deberán utilizarse las técnicas que mejoran la profundidad de campo del haz de electrones en el estudio de muestras de espesor. Estudios recientes han informado de la adquisición de varias imágenes en diferentes planos focales en toda la muestra de recuperar la máxima cantidad de información que tiene el foco ^{13, 14.} Los dos estudios describen diferentes maneras de manejar la información de los diferentes planos focales. Hovden et al.combinan en el espacio de Fourier de las imágenes que se recogieron en diferentes planos focales, y se obtuvo la reconstrucción final directamente a partir de la inversa 3D transformada de Fourier ^13. Por el contrario, Dahmen et al. desarrollado un motor de reconstrucción de haz convergente para reconstruir en el espacio real del volumen 3D a partir de los diferentes planos focales ^14. Nuestro laboratorio también desarrolló un método para obtener imágenes de muestras biológicas de espesor. Nuestra estrategia era diferente de los dos métodos descritos anteriormente en que nos fusionamos la información que está en el foco en los diferentes planos focales y reconstruido el volumen final en 3D en el espacio real mediante un proyector de haz paralelo ^15. Nuestro objetivo fue desarrollar un método que se puede realizar fácilmente en cualquier laboratorio de microscopía electrónica. Con este fin, que tuvo como objetivo recoger las imágenes focales en una cantidad limitada de tiempo, comparable con el marco de tiempo de los experimentos de tomografía convencionales. Además, nuestra propuesta de método de could ser adaptado para su uso con diferentes tipos de alineación y software de reconstrucción.

En el contexto de nuestra publicación a partir de 2015 ^15, queríamos visualizar y caracterizar la recuperación de la profundidad de campo, por lo que se utilizó una gran convergencia semi-ángulo de 25 mrad. A continuación, presentamos un protocolo paso a paso para realizar a través focal imágenes in STEM de acuerdo con el método desarrollado en nuestro laboratorio en 2015 ^15, y presentamos cómo se procesan los datos de 2015. Este método recupera la información que tiene el foco de varios planos focales a lo largo de un (750 nm) muestra biológica de espesor y permite reconstrucciones en 3D de alta calidad. En su caso, también se presentan las diferencias en esta metodología en comparación con los métodos utilizados por otros grupos.

Protocol

Precaución: Consulte las hojas de datos de seguridad del material (MSDS) de los diversos reactivos antes de usarlos. Varios de los productos químicos utilizados durante la preparación de la muestra son tóxicos, carcinogénicos, mutagénicos y / o tóxicos para la reproducción. Usar el equipo de protección personal (guantes, bata de laboratorio, pantalones largos y zapatos cerrados) y el trabajo bajo una campana de humos durante la manipulación de la muestra. Seccionar la muestra con un ultramicrotomo implica el u…

Representative Results

En nuestro estudio, los electrones se aceleran a 200 kV en el microscopio electrónico de transmisión cañón de emisión de campo. Las imágenes se recogieron en modo STEM BF utilizando un tiempo de permanencia de 20 mu s. En cuanto al diseño de la serie de inclinación a través de-focal, encontramos que los intervalos de enfoque de 150 nm dieron resultados satisfactorios para el estudio ultraestructural de una muestra, incluso biológica 750 nm de espesor, aunque la profundidad de c…

Discussion

En este artículo, se presenta un protocolo de preparación de muestras convencional junto con una guía paso a paso para realizar el análisis 3D en muestras biológicas de espesor utilizando la tomografía por STEM-focal. Resina incrustación de muestras biológicas se ha utilizado durante décadas ²⁶ y protocolos alternativos que se adaptan a diferentes tipos de muestras se pueden encontrar en la literatura ^27. Por el contrario, las muestras gruesas de imagen en STEM es…

Materials

Phosphate Buffered Saline	Sigma-Aldrich	P4417
Ethanol	Sigma-Aldrich	2860
Epoxy resin	EMS	14120
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	Add paraformaldehyde powder to PBS heated at approximately 60 °C. Increase pH by adding 1 N NaOH until no PFA powder is visible.
Glutaraldehyde	Sigma-Aldrich	G5882
Osmium Tetroxyde	EMS	19150
Uranyl Acetate	Sigma-Aldrich	73943
Gelatin Capsule	EMS	70110
Triming and Histo knives	LFG Distribution	Diatome diamond knives
Electron Microscopy copper grid	LFG Distribution	G200-Cu
Grid Coating Pen	LFG Distribution	70624
Specimen Holder	JEOL	EM-21311 HTR
Electron Microscope	JEOL	JEM-2200FS