Chondrogenese fra stamceller kræver finjustering dyrkningsbetingelserne. Her præsenterer vi en magnetisk tilgang til kondenserende celler, at et vigtigt skridt initiere chondrogenese. Derudover viser vi, at dynamisk modning i en bioreaktor gælder mekanisk stimulering til de cellulære konstruktioner og øger bruskagtig extracellulær matrixproduktion.
Brusk engineering fortsat en udfordring på grund af vanskelighederne med at skabe en in vitro funktionel implantat ligner det native væv. En tilgang nylig undersøgt for udvikling af autologe udskiftninger involverer differentiering af stamceller til chondrocytter. For at påbegynde denne chondrogenese, en komprimeringsgrad af stamcellerne er påkrævet; derfor demonstrerede vi muligheden for magnetisk kondenserende celler, både inden tykke stilladser og stillads-fri, under anvendelse af miniaturiserede magnetiske kilder som celle attractors. Denne magnetiske fremgangsmåde blev også anvendt til at styre aggregat fusion og opbygge stillads-fri, organiseret, tredimensionale (3D) væv flere millimeter i størrelse. Ud over at have en forbedret størrelse, dannet af magnetisk drevne fusion væv præsenteret en signifikant stigning i ekspressionen af kollagen II, og der blev observeret en lignende tendens til aggrecan-ekspression. Som det native brusk blev underkastet kræfter that påvirket sin 3D-struktur, var dynamisk modning også udført. En bioreaktor, der giver mekaniske stimuli blev anvendt til at dyrke de magnetisk podet stilladser over en periode på 21 dage. Bioreaktor modning i høj grad forbedret chondrogenese i cellularized stilladser; den ekstracellulære matrix opnået under disse betingelser var rig på kollagen II og aggrecan. Dette arbejde beskriver innovative potentiale magnetisk kondensering af mærkede stamceller og dynamisk modning i en bioreaktor til forbedret chondrogen differentiering, både scaffold-fri og inden polysaccharid stilladser.
Magnetiske nanopartikler anvendes allerede i klinikken som kontrastmidler til magnetisk resonans imaging (MRI), og deres terapeutiske anvendelser holde udvide. For eksempel er det for nylig blevet vist, at mærkede celler kan manipuleres in vivo under anvendelse af et eksternt magnetisk felt, og kan ledes og / eller opretholdes ved en defineret implantationsstedet 1, 2, 3. I regenerativ medicin, kan de anvendes til at konstruere organiserede væv in vitro 4, herunder karvæv 5, 6, 7, knogle 8, og brusk 9.
Ledbrusk er nedsænket i en avaskulær miljø, hvilket gør reparationer af de ekstracellulære matrixkomponenter meget begrænsede, når skaden indtræffer. Af denne grund, researchfirmaerneh er i øjeblikket fokuseret på engineering af hyaline brusk udskiftninger, der kan implanteres i det defekte område. For at fremstille et autologt udskiftning, er nogle forskningsgrupper udforske anvendelsen af autologe chondrocytter som en cellekilde 10, 11, mens andre understreger kapaciteten af mesenkymale stamceller (MSC) til at differentiere til chondrocytter 12, 13. I tidligere undersøgelser er gengivet, valgte vi MSC, som deres knoglemarv prøveudtagning er forholdsvis enkel og kræver ikke det offer af sunde chondrocytter, som risikerer at miste deres fænotype 14.
Et tidligt trin vigtigt at indlede den chondrogene differentiering af stamceller er deres kondens. Celleaggregater dannes almindeligvis ved anvendelse af enten centrifugering eller mikromassekultur 15; men disse kondensationsmetoder neither præsentere potentiale til at skabe celleklynger inden tykke stilladser eller potentialet til at kontrollere fusionen af aggregater. I dette papir, beskriver vi en innovativ tilgang til kondenserende stamceller under anvendelse af MSC magnetisk mærkning og magnetiske tiltrækning. Denne teknik har vist sig at danne stillads-fri 3D konstruktioner via fusion af aggregater med hinanden for at opnå en millimeter-skala bruskvæv 9. Magnetisk podning af tykke og store skeletter har også givet mulighed for at øge størrelsen af den konstruerede væv, designe en form lettere anvendelig til implantering, og diversificering af potentialet for kliniske anvendelser i brusk reparation. Her, vi detaljeret protokol for den magnetiske podning af MSC i porøse stilladser sammensat af naturlige polysaccharider, pullulan og dextran, stilladser tidligere blev anvendt til at begrænse stamceller 16, 17. Chondrogen differentiering var finally udført i en bioreaktor for at sikre løbende næringsstof og gas diffusion i matricen kerne af skeletter podet med en høj tæthed af celler. Ud over at give næringsstoffer, chondrogene vækstfaktorer og gas til cellerne, bioreaktoren tilbød mekanisk stimulation. Samlet set den magnetiske teknologi anvendes til at begrænse stamceller, kombineret med dynamisk modning i en bioreaktor, kan markant forbedre chondrogen differentiering.
For det første fordi de teknikker, der præsenteres her stole på internalisering af magnetiske nanopartikler, en vigtigt spørgsmål er resultatet af nanopartiklerne, når de lokaliserer i cellerne. Det er korrekt, jern nanopartikler kan udløse potentiel toksicitet eller forringet differentieringskapacitet afhængig af deres størrelse, belægning, og eksponeringstiden 19, 22. Imidlertid har flere undersøgelser vist nogen indvirkning på cellulær fysiologi,…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne anerkende QuinXell Technologies og CellD, især Lothar Grannemann og Dominique Ghozlan for deres hjælp med bioreaktoren. Vi takker Catherine Le Visage, der har givet os med pullulanet / dextran polysaccharid stilladser. Dette arbejde blev støttet af Den Europæiske Union (ERC-2014-cog projekt Matisse 648.779) og af AgenceNationalede Recherche (ANR), Frankrig (MagStem projekt ANR-11 SVSE5).
Iron oxide (maghemite) nanoparticules ( γ-Fe2O3) | PHENIX – University Paris 6 | Made and given by C. Ménager | Mean diameter of 8.1 nm and negative surface charge |
Polysaccharide Pullulan/Dextran scaffolds | LIOAD – University Nantes | Made and given by C. Le Visage | Prepared from a 75:25 mixture of pullulan/dextran in alkaline conditions (10M NaOH). Porosity: 185-205µm; Thickness: 7mm; Surface area: 1.8cm2. |
TisXell Regeneration System | QuinXell Technologies | QX900-002 | Biaxial bioreactor with 500 mL culture chamber |
Cage for scaffolds: Histosette II M492 | VWR | 720-0909 | |
Mesenchymal Stem Cell (MSC) | Lonza | PT-2501 | Three independant batches have been used |
MSCGM BulletKit medium | Lonza | PT-3001 | For the complete medium, add the provided BulletKit (containing serum, glutamine and antibiotics) to the MSCGM medium |
DMEM with Glutamax I | Life Technologies | 31966-021 | No sodium pyruvate, no HEPES |
RPMI medium 1640, no Glutamine | Life Technologies | 31870-025 | No sodium pyruvate, no HEPES |
PBS w/o CaCl2 w/o MgCl2 | Life Technologies | 14190-094 | |
0.05% Trypsin-EDTA (1x) | Life Technologies | 25300-054 | |
Penicillin (10.000U/mL)/Streptomicin (10.000µg/mL) | Life Technologies | 15140-122 | |
ITS Premix Universal Culture Supplement (20x) | Corning | 354352 | |
Sodium pyruvate solution 100mM | Sigma | S8636 | |
L-Ascorbic Acid 2-phosphate | Sigma | A8960 | Prepare the concentrated solution (25 mM) in distilled water extemporaneously |
L-Proline | Sigma | P5607 | Prepare the 175 mM stock solution diluted in distilled water and store at 4°C |
Dexamethasone | Sigma | D4902 | Prepare the 1 mM stock solution diluted in Ethanol 100% and store at -20°C |
TGF-beta 3 protein 10µg | Interchim | 30R-AT028 | |
Tri-sodium citrate | VWR | 33615.268 | Prepare the 1M stock solution diluted in distilled water and store at 4°C |
Pullulanase from Bacillus acidopullulyticus | Sigma | P2986 | |
Dextranase from Chaetomium erraticum | Sigma | D0443 | |
NucleoSpin RNA Extraction Kit | Macherey-Nagel | 740955.5 | |
SuperScript II Reverse Transcriptase | Life Technologies | 18064-014 | |
Random Primer – Hexamer | Promega | C1181 | 500 µg/mL: Use diluted 1/2 and put 1 µL per sample |
Recombinant RNAsin ribonuclease inhibitor | Promega | N2511 | 40 U/µL: put 1 µL per sample |
PCR nucleotide dNTP mix (10mM each) | Roche | 10842321 | |
SyBr Green PCR Master Mix | Life Technologies | 4368708 | |
Step One Plus Real-Time PCR System | Life Technologies | 4381792 | |
Formalin solution 10% neutral buffered | Sigma | HT5012 | |
OCT solution | VWR | 361603E | |
Isopentane | Sigma | M32631 | |
Toluidine blue O | VWR | 1.15930.0025 | |
Ethanol absolute | VWR | 20821.310 | |
Toluene | VWR | 1.08323.1000 | |
Mounting medium Pertex | Histolab | 840 | |
RPLP0 Primer for qPCR | Eurogentec | 5'-TGCATCAGTAC CCCATTCTATCAT-3' ; 5'-AAGGTGTAATC CGTCTCCACAGA-3' |
|
Aggrecan Primer for qPCR | Eurogentec | 5'-TCTACCGCTGCGAGGTGAT-3' ; 3'-TGTAATGGAACACGATGCCTTT-5' | |
Collagen II Primer for qPCR | Eurogentec | 5'-ACTGGATTGACCCCAACCAA-3' ; 3'-TCCATGTTGCAGAAAACCTTCA-5' |