3D Magnetisk Stem Cell Aggregering og bioreaktor Modning til Brusk Regeneration
Summary
Chondrogenese fra stamceller kræver finjustering dyrkningsbetingelserne. Her præsenterer vi en magnetisk tilgang til kondenserende celler, at et vigtigt skridt initiere chondrogenese. Derudover viser vi, at dynamisk modning i en bioreaktor gælder mekanisk stimulering til de cellulære konstruktioner og øger bruskagtig extracellulær matrixproduktion.
Abstract
Brusk engineering fortsat en udfordring på grund af vanskelighederne med at skabe en in vitro funktionel implantat ligner det native væv. En tilgang nylig undersøgt for udvikling af autologe udskiftninger involverer differentiering af stamceller til chondrocytter. For at påbegynde denne chondrogenese, en komprimeringsgrad af stamcellerne er påkrævet; derfor demonstrerede vi muligheden for magnetisk kondenserende celler, både inden tykke stilladser og stillads-fri, under anvendelse af miniaturiserede magnetiske kilder som celle attractors. Denne magnetiske fremgangsmåde blev også anvendt til at styre aggregat fusion og opbygge stillads-fri, organiseret, tredimensionale (3D) væv flere millimeter i størrelse. Ud over at have en forbedret størrelse, dannet af magnetisk drevne fusion væv præsenteret en signifikant stigning i ekspressionen af kollagen II, og der blev observeret en lignende tendens til aggrecan-ekspression. Som det native brusk blev underkastet kræfter that påvirket sin 3D-struktur, var dynamisk modning også udført. En bioreaktor, der giver mekaniske stimuli blev anvendt til at dyrke de magnetisk podet stilladser over en periode på 21 dage. Bioreaktor modning i høj grad forbedret chondrogenese i cellularized stilladser; den ekstracellulære matrix opnået under disse betingelser var rig på kollagen II og aggrecan. Dette arbejde beskriver innovative potentiale magnetisk kondensering af mærkede stamceller og dynamisk modning i en bioreaktor til forbedret chondrogen differentiering, både scaffold-fri og inden polysaccharid stilladser.
Introduction
Magnetiske nanopartikler anvendes allerede i klinikken som kontrastmidler til magnetisk resonans imaging (MRI), og deres terapeutiske anvendelser holde udvide. For eksempel er det for nylig blevet vist, at mærkede celler kan manipuleres in vivo under anvendelse af et eksternt magnetisk felt, og kan ledes og / eller opretholdes ved en defineret implantationsstedet 1, 2, 3. I regenerativ medicin, kan de anvendes til at konstruere organiserede væv in vitro 4, herunder karvæv 5, 6, 7, knogle 8, og brusk 9.
Ledbrusk er nedsænket i en avaskulær miljø, hvilket gør reparationer af de ekstracellulære matrixkomponenter meget begrænsede, når skaden indtræffer. Af denne grund, researchfirmaerneh er i øjeblikket fokuseret på engineering af hyaline brusk udskiftninger, der kan implanteres i det defekte område. For at fremstille et autologt udskiftning, er nogle forskningsgrupper udforske anvendelsen af autologe chondrocytter som en cellekilde 10, 11, mens andre understreger kapaciteten af mesenkymale stamceller (MSC) til at differentiere til chondrocytter 12, 13. I tidligere undersøgelser er gengivet, valgte vi MSC, som deres knoglemarv prøveudtagning er forholdsvis enkel og kræver ikke det offer af sunde chondrocytter, som risikerer at miste deres fænotype 14.
Et tidligt trin vigtigt at indlede den chondrogene differentiering af stamceller er deres kondens. Celleaggregater dannes almindeligvis ved anvendelse af enten centrifugering eller mikromassekultur 15; men disse kondensationsmetoder neither præsentere potentiale til at skabe celleklynger inden tykke stilladser eller potentialet til at kontrollere fusionen af aggregater. I dette papir, beskriver vi en innovativ tilgang til kondenserende stamceller under anvendelse af MSC magnetisk mærkning og magnetiske tiltrækning. Denne teknik har vist sig at danne stillads-fri 3D konstruktioner via fusion af aggregater med hinanden for at opnå en millimeter-skala bruskvæv 9. Magnetisk podning af tykke og store skeletter har også givet mulighed for at øge størrelsen af den konstruerede væv, designe en form lettere anvendelig til implantering, og diversificering af potentialet for kliniske anvendelser i brusk reparation. Her, vi detaljeret protokol for den magnetiske podning af MSC i porøse stilladser sammensat af naturlige polysaccharider, pullulan og dextran, stilladser tidligere blev anvendt til at begrænse stamceller 16, 17. Chondrogen differentiering var finally udført i en bioreaktor for at sikre løbende næringsstof og gas diffusion i matricen kerne af skeletter podet med en høj tæthed af celler. Ud over at give næringsstoffer, chondrogene vækstfaktorer og gas til cellerne, bioreaktoren tilbød mekanisk stimulation. Samlet set den magnetiske teknologi anvendes til at begrænse stamceller, kombineret med dynamisk modning i en bioreaktor, kan markant forbedre chondrogen differentiering.
Protocol
Representative Results
Discussion
For det første fordi de teknikker, der præsenteres her stole på internalisering af magnetiske nanopartikler, en vigtigt spørgsmål er resultatet af nanopartiklerne, når de lokaliserer i cellerne. Det er korrekt, jern nanopartikler kan udløse potentiel toksicitet eller forringet differentieringskapacitet afhængig af deres størrelse, belægning, og eksponeringstiden 19, 22. Imidlertid har flere undersøgelser vist nogen indvirkning på cellulær fysiologi,…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne anerkende QuinXell Technologies og CellD, især Lothar Grannemann og Dominique Ghozlan for deres hjælp med bioreaktoren. Vi takker Catherine Le Visage, der har givet os med pullulanet / dextran polysaccharid stilladser. Dette arbejde blev støttet af Den Europæiske Union (ERC-2014-cog projekt Matisse 648.779) og af AgenceNationalede Recherche (ANR), Frankrig (MagStem projekt ANR-11 SVSE5).
Materials
| Iron oxide (maghemite) nanoparticules ( γ-Fe2O3) | PHENIX – University Paris 6 | Made and given by C. Ménager | Mean diameter of 8.1 nm and negative surface charge |
| Polysaccharide Pullulan/Dextran scaffolds | LIOAD – University Nantes | Made and given by C. Le Visage | Prepared from a 75:25 mixture of pullulan/dextran in alkaline conditions (10M NaOH). Porosity: 185-205µm; Thickness: 7mm; Surface area: 1.8cm2. |
| TisXell Regeneration System | QuinXell Technologies | QX900-002 | Biaxial bioreactor with 500 mL culture chamber |
| Cage for scaffolds: Histosette II M492 | VWR | 720-0909 | |
| Mesenchymal Stem Cell (MSC) | Lonza | PT-2501 | Three independant batches have been used |
| MSCGM BulletKit medium | Lonza | PT-3001 | For the complete medium, add the provided BulletKit (containing serum, glutamine and antibiotics) to the MSCGM medium |
| DMEM with Glutamax I | Life Technologies | 31966-021 | No sodium pyruvate, no HEPES |
| RPMI medium 1640, no Glutamine | Life Technologies | 31870-025 | No sodium pyruvate, no HEPES |
| PBS w/o CaCl2 w/o MgCl2 | Life Technologies | 14190-094 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x) | Life Technologies | 25300-054 | |
| Penicillin (10.000U/mL)/Streptomicin (10.000µg/mL) | Life Technologies | 15140-122 | |
| ITS Premix Universal Culture Supplement (20x) | Corning | 354352 | |
| Sodium pyruvate solution 100mM | Sigma | S8636 | |
| L-Ascorbic Acid 2-phosphate | Sigma | A8960 | Prepare the concentrated solution (25 mM) in distilled water extemporaneously |
| L-Proline | Sigma | P5607 | Prepare the 175 mM stock solution diluted in distilled water and store at 4°C |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | Prepare the 1 mM stock solution diluted in Ethanol 100% and store at -20°C |
| TGF-beta 3 protein 10µg | Interchim | 30R-AT028 | |
| Tri-sodium citrate | VWR | 33615.268 | Prepare the 1M stock solution diluted in distilled water and store at 4°C |
| Pullulanase from Bacillus acidopullulyticus | Sigma | P2986 | |
| Dextranase from Chaetomium erraticum | Sigma | D0443 | |
| NucleoSpin RNA Extraction Kit | Macherey-Nagel | 740955.5 | |
| SuperScript II Reverse Transcriptase | Life Technologies | 18064-014 | |
| Random Primer – Hexamer | Promega | C1181 | 500 µg/mL: Use diluted 1/2 and put 1 µL per sample |
| Recombinant RNAsin ribonuclease inhibitor | Promega | N2511 | 40 U/µL: put 1 µL per sample |
| PCR nucleotide dNTP mix (10mM each) | Roche | 10842321 | |
| SyBr Green PCR Master Mix | Life Technologies | 4368708 | |
| Step One Plus Real-Time PCR System | Life Technologies | 4381792 | |
| Formalin solution 10% neutral buffered | Sigma | HT5012 | |
| OCT solution | VWR | 361603E | |
| Isopentane | Sigma | M32631 | |
| Toluidine blue O | VWR | 1.15930.0025 | |
| Ethanol absolute | VWR | 20821.310 | |
| Toluene | VWR | 1.08323.1000 | |
| Mounting medium Pertex | Histolab | 840 | |
| RPLP0 Primer for qPCR | Eurogentec | 5'-TGCATCAGTAC CCCATTCTATCAT-3' ; 5'-AAGGTGTAATC CGTCTCCACAGA-3' |
|
| Aggrecan Primer for qPCR | Eurogentec | 5'-TCTACCGCTGCGAGGTGAT-3' ; 3'-TGTAATGGAACACGATGCCTTT-5' | |
| Collagen II Primer for qPCR | Eurogentec | 5'-ACTGGATTGACCCCAACCAA-3' ; 3'-TCCATGTTGCAGAAAACCTTCA-5' |
References
- Naumova, A. V., Modo, M., Moore, A., Murry, C. E., Frank, J. A. Clinical imaging in regenerative medicine. Nat Biotechnol. 32 (8), 804-818 (2014).
- Edmundson, M., Thanh, N. T., Song, B. Nanoparticles based stem cell tracking in regenerative medicine. Theranostics. 3 (8), 573-582 (2013).
- Di Corato, R., et al. High-resolution cellular MRI: gadolinium and iron oxide nanoparticles for in-depth dual-cell imaging of engineered tissue constructs. ACS Nano. 7 (9), 7500-7512 (2013).
- Xu, F., et al. Three-dimensional magnetic assembly of microscale hydrogels. Adv Mater. 23 (37), 4254-4260 (2011).
- Kito, T., et al. iPS cell sheets created by a novel magnetite tissue engineering method for reparative angiogenesis. Sci Rep. 3, 1418 (2013).
- Mironov, V., Kasyanov, V., Markwald, R. R. Nanotechnology in vascular tissue engineering: from nanoscaffolding towards rapid vessel biofabrication. Trends Biotechnol. 26 (6), 338-344 (2008).
- Mattix, B. M., et al. Janus magnetic cellular spheroids for vascular tissue engineering. Biomaterials. 35 (3), 949-960 (2014).
- Henstock, J., El Haj, A. Controlled mechanotransduction in therapeutic MSCs: can remotely controlled magnetic nanoparticles regenerate bones?. Regen Med. 10 (4), 377-380 (2015).
- Fayol, D., et al. Use of magnetic forces to promote stem cell aggregation during differentiation, and cartilage tissue modeling. Adv Mater. 25 (18), 2611-2616 (2013).
- Bartlett, W., et al. Autologous chondrocyte implantation versus matrix-induced autologous chondrocyte implantation for osteochondral defects of the knee: a prospective, randomised study. J Bone Joint Surg Br. 87 (5), 640-645 (2005).
- Batty, L., Dance, S., Bajaj, S., Cole, B. J. Autologous chondrocyte implantation: an overview of technique and outcomes. ANZ J Surg. 81, 18-25 (2011).
- Song, L., Baksh, D., Tuan, R. S. Mesenchymal stem cell-based cartilage tissue engineering: cells, scaffold and biology. Cytotherapy. 6 (6), 596-601 (2004).
- Boeuf, S., Richter, W. Chondrogenesis of mesenchymal stem cells: role of tissue source and inducing factors. Stem Cell Res Ther. 1 (4), 31 (2010).
- Kock, L., van Donkelaar, C. C., Ito, K. Tissue engineering of functional articular cartilage: the current status. Cell Tissue Res. 347 (3), 613-627 (2012).
- Schon, B. S., et al. Validation of a high-throughput microtissue fabrication process for 3D assembly of tissue engineered cartilage constructs. Cell Tissue Res. , (2012).
- Robert, D., et al. Magnetic micro-manipulations to probe the local physical properties of porous scaffolds and to confine stem cells. Biomaterials. 31 (7), 1586-1595 (2010).
- Luciani, N., et al. Successful chondrogenesis within scaffolds, using magnetic stem cell confinement and bioreactor maturation. Acta Biomaterialia. 37, 101-110 (2016).
- Wilhelm, C., Gazeau, F. Universal cell labelling with anionic magnetic nanoparticles. Biomaterials. 29 (22), 3161-3174 (2008).
- Fayol, D., Luciani, N., Lartigue, L., Gazeau, F., Wilhelm, C. Managing magnetic nanoparticle aggregation and cellular uptake: a precondition for efficient stem-cell differentiation and MRI tracking. Adv Healthc Mater. 2 (2), 313-325 (2013).
- Wilhelm, C., Gazeau, F., Bacri, J. C. Magnetophoresis and ferromagnetic resonance of magnetically labeled cells. Eur Biophys J. 31 (2), 118-125 (2002).
- Autissier, A., Le Visage, C., Pouzet, C., Chaubet, F., Letourneur, D. Fabrication of porous polysaccharide-based scaffolds using a combined freeze-drying/cross-linking process. Acta Biomater. 6 (9), 3640-3648 (2010).
- Singh, N., Jenkins, G. J. S., Asadi, R., Doak, S. H. Potential toxicity of superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPION). Nano Reviews. 1, (2010).
- Lee, J. H., Hur, W. Scaffold-free formation of a millimeter-scale multicellular spheroid with an internal cavity from magnetically levitated 3T3 cells that ingested iron oxide-containing microspheres. Biotechnol Bioeng. 111 (5), 1038-1047 (2014).
- Mattix, B., et al. Biological magnetic cellular spheroids as building blocks for tissue engineering. Acta Biomaterialia. 10 (2), 623-629 (2014).
- Mazuel, F., et al. Massive Intracellular Biodegradation of Iron Oxide Nanoparticles Evidenced Magnetically at Single-Endosome and Tissue Levels. ACS Nano. 10 (8), 7627-7638 (2016).
- Kim, J. A., et al. High-throughput generation of spheroids using magnetic nanoparticles for three-dimensional cell culture. Biomaterials. 34 (34), 8555-8563 (2013).
- Shimizu, K., Ito, A., Honda, H. Enhanced cell-seeding into 3D porous scaffolds by use of magnetite nanoparticles. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 77 (2), 265-272 (2006).
- Sensenig, R., Sapir, Y., MacDonald, C., Cohen, S., Polyak, B. Magnetic nanoparticle-based approaches to locally target therapy and enhance tissue regeneration in vivo. Nanomedicine (Lond). 7 (9), 1425-1442 (2012).
- Waldman, S. D., Couto, D. C., Grynpas, M. D., Pilliar, R. M., Kandel, R. A. Multi-axial mechanical stimulation of tissue engineered cartilage: review. Eur Cell Mater. 13, 66-74 (2007).
- Takahashi, I., et al. Compressive force promotes sox9, type II collagen and aggrecan and inhibits IL-1beta expression resulting in chondrogenesis in mouse embryonic limb bud mesenchymal cells. J Cell Sci. 111 (14), 2067-2076 (1998).
- Campbell, J. J., Lee, D. A., Bader, D. L. Dynamic compressive strain influences chondrogenic gene expression in human mesenchymal stem cells. Biorheology. 43, 455-470 (2006).
- Vunjak-Novakovic, G., et al. Bioreactor cultivation conditions modulate the composition and mechanical properties of tissue-engineered cartilage. J Orthop Res. 17 (1), 130-138 (1999).
