Funzionalità di misurazione della giunzione neuromuscolare
Summary
Una valutazione funzionale della giunzione neuromuscolare (NMJ) può fornire informazioni essenziali sulla comunicazione tra nervo e del muscolo. Qui descriviamo un protocollo per valutare globalmente la giunzione neuromuscolare e il muscolo funzionalità utilizzando due preparazioni diverse del nervo-muscolo, cioè Soleo-sciatic e diaframma-frenico.
Abstract
Funzionalità della giunzione neuromuscolare (NMJ) svolge un ruolo fondamentale nello studio di malattie in cui la comunicazione tra il motoneurone e il muscolo è alterata, come invecchiamento e sclerosi laterale amiotrofica (ALS). Qui descriviamo un protocollo sperimentale che può essere utilizzato per misurare la funzionalità NMJ combinando due tipi di stimolazione elettrica: diretta stimolazione della membrana muscolare e la stimolazione attraverso il nervo. Il confronto della risposta muscolare a queste due diverse stimolazioni può aiutare a definire, a livello funzionale, potenziali alterazioni nella giunzione neuromuscolare che portano al declino funzionale nel muscolo.
Preparazioni dix vivo E sono adatti a studi ben controllati. Qui descriviamo un protocollo intensivo per misurare diversi parametri del muscolo e funzionalità NMJ per la preparazione del nervo sciatico soleo e per la preparazione del nervo frenico a membrana. Il protocollo dura circa 60 min e viene condotta ininterrottamente per mezzo di un su misura software che misura le proprietà di cinetica di contrazione, il rapporto di forza-frequenza per stimolazioni del nervo e del muscolo e due parametri specifici per funzionalità NMJ, cioè la neurotrasmissione guasto e la fatica intratetanic. Questa metodologia è stata utilizzata per rilevare danni nelle preparazioni di nervo del muscolo soleo e diaframma utilizzando mouse transgenico SOD1G93A , un modello sperimentale di ALS che overexpresses ubiquistmente il mutante antiossidante degli enzimi superossido dismutasi 1 (SOD1).
Introduction
La giunzione neuromuscolare (NMJ) è un prodotto chimico sinapsi formato dalla connessione tra il terminale del motoneurone della fibra muscolare e l’assone del neurone di motore terminal. NMJ ha dimostrato di giocare un ruolo cruciale quando la comunicazione tra il nervo e del muscolo è alterata, come si verifica nell’invecchiamento o sclerosi laterale amiotrofica (ALS). Come nervo e del muscolo di comunicare in modo bidirezionale1,2, potendo misurare NMJ difetti separatamente da difetti muscolari può fornire nuove intuizioni loro interazione fisiopatologici. Infatti, questa valutazione funzionale può aiutare a valutare se le alterazioni morfologiche o biochimiche riducono neurotrasmissione funzionalità di segnalazione.
Il confronto della risposta contrattile del muscolo suscitato da stimolazione del nervo e la risposta del muscolo stesso evocata dalla stimolazione diretta della sua membrana è stata proposta come una misura indiretta di funzionalità NMJ. Infatti, dal neurotrasmissione di by-pass di stimolazione della membrana di segnalazione, eventuali differenze nelle due risposte contrattili possono essere attribuite ai cambiamenti nella giunzione neuromuscolare. Questo approccio è stato ampiamente proposto per ratti3,4,5,6,7e utilizzato anche per raccogliere informazioni su mouse modelli8,9,10,11,12.
Qui, descriviamo in dettaglio una procedura per asportare e testare due preparati di nervo del muscolo, cioè i preparativi Soleo-sciatic e diaframma-frenico. Utilizzando un su misura software, abbiamo progettato un protocollo di test continuo che combina la misurazione di diversi parametri che caratterizzano la funzionalità del muscolo e NMJ, quindi ottenendo una valutazione completa del danno NMJ separatamente da quella del muscolo. In particolare, il protocollo di misura la forza di contrazione, la cinetica di muscolo, la curva di forza-frequenza per diretta e stimolazioni nervose, la neurotrasmissione guasto13 per un infornamento e le frequenze tetaniche e la fatica di intratetanic7.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo sperimentale descritto sopra fornisce un modo ideale di misurazione e discriminare eventuali alterazioni funzionali che si sono verificati direttamente nel muscolo o indirettamente a livello della giunzione neuromuscolare. Poiché questa tecnica è basata su una misura indiretta di funzionalità NMJ, non può essere utilizzato per stabilire se qualsiasi difetto è correlato a cambiamenti morfologici o cambiamenti biochimici. Al contrario, fornisce un modo efficace di determinare se eventuali alterazioni mor…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Lavoro in laboratorio degli autori è stato sostenuto dalla Fondazione Roma e Telethon (grant no. GGP14066).
Materials
| Dual-Mode Lever System | Aurora Scientific Inc. | 300B | actuator/transducer |
| High-Power Bi-Phase Stimulator | Aurora Scientific Inc. | 701B | pulse stimulator (nerve) |
| High-Power Bi-Phase Stimulator | Aurora Scientific Inc. | 701C | pulse stimulator (muscle) |
| In vitro Muscle Apparatus | Aurora Scientific Inc. | 800A | |
| Preparatory tissue bath | Radnoti | 158400 | |
| Monopolar Suction Electrode | A-M Systems | 573000 | with a home-made reference |
| Oscilloscope | Tektronix | TDS2014 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ 800 | |
| Cold light illuminator | Photonic Optics | PL 3000 | |
| Acquisition board | National Instruments | NI PCIe-6353 | |
| Connector block | National Instruments | NI 2110 | |
| Personal computer | AMD Phenom II x4 970 | Processor 3.50 Ghz with Windows 7 | |
| LabView 2012 software | National Instruments | ||
| Krebs-Ringer Bicarbonate Buffer | Sigma-Aldrich | K4002 | physiological buffer |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Calcium chloride CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | anhydrous, powder, ≥97% |
| Potassium dihydrogen phosphate KH₂PO₄ | AnalaR | 7778-77-0 | |
| Magnesium sulphate MgSO₄ | AnalaR | 7487-88-9 | |
| Buffer HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | ≥99.5% (titration) |
| Dishes 60mm x 15mm | Falcon | 353004 | Polystyrene |
| Silicone | Sylgard | 184 Silicone | Elastomer Kit 0.5Kg. |
| Thermostat | Dennerle | DigitalDuomat 1200 | |
| Pump | Newa Mini | MN 606 | for aquarium |
| Heat resistance Thermocable | Lucky Reptile | 61403-1 | 50/60Hz 50W |
| Bucket | any 10 liters | Polypropylene | |
| O2 + 5%CO2 | siad | Mix gas | |
| #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | 2 items |
| Spring Scissors – 8 mm Blades | Fine Science Tools | 15024-10 | nerve excision |
| Sharp Scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | muscle removal |
| Delicate Scissors | Wagner | 02.06.32 | external of the animal |
| Student Scalpel Handle #3 | Fine Science Tools | 91003-12 | |
| Scalpel Blades #10 | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Scalpel Blades #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| nylon wire Ø0.16 mm | any |
References
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