En funksjonell vurdering av nevromuskulær krysset (NMJ) kan gi viktig informasjon om kommunikasjonen mellom muskler og nerve. Her beskriver vi en protokoll for grundig vurdere både NMJ og muskel funksjonaliteten med to forskjellige muskel-nerve preparater, i.e. soleus-ischias og membran-phrenic.
Nevromuskulær krysset (NMJ) funksjonaliteten spiller en avgjørende rolle når studere sykdommer der kommunikasjonen mellom motor neuron og muskel er svekket, som aldring og amyotrofisk lateral sklerose (ALS). Her beskriver vi en eksperimentell protokoll som kan brukes til å måle NMJ funksjonalitet ved å kombinere to typer elektrisk stimulering: direkte membran muskelstimulasjon og stimulering gjennom nerve. Sammenligning av muskel respons på disse to forskjellige stimulations kan bidra til å definere, på funksjonell nivå, mulige endringer i NMJ som fører til funksjonelle nedgang i muskel.
Ex vivo forberedelser er velegnet for godt kontrollerte studier. Her beskriver vi en intensiv protokoll for å måle flere parametere av muskel- og NMJ funksjonalitet for soleus-sciatic nerve utarbeidelse og membran-phrenic nerve forberedelse. Protokollen varer ca 60 min og utføres uavbrutt gjennom et skreddersydd programvare som måler egenskapene twitch kinetikk, kraft-frekvens forholdet for både muskel- og stimulations og to parametere gjelder for NMJ funksjonaliteten, i.e. neurotransmission svikt og intratetanic trøtthet. Denne metoden ble brukt til å oppdage skader i soleus og membran muskel-nerve forberedelser ved hjelp SOD1G93A transgene musen, en eksperimentell modell av ALS som overalt overexpresses mutant antioksidant enzymet superoxide dismutase 1 (SOD1).
Nevromuskulær krysset (NMJ) er en kjemisk synapse dannet av forbindelsen mellom den motor endplate av muskel fiber og motor neuron axon terminal. NMJ har vist seg å spille en avgjørende rolle når kommunikasjonen mellom muskler og nerve er svekket, som forekommer i aldring eller amyotrofisk lateral sklerose (ALS). Som muskel- og kommunisere på et toveis måte1,2, kan å kunne måle NMJ feil separat fra muskel defekter gi ny innsikt i deres physiopathological samspill. Faktisk kan denne funksjonelle evalueringen hjelpe for å vurdere om morfologiske eller biokjemiske endringer redusere neurotransmission signalering funksjonalitet.
Sammenligning av muskel kontraktile respons skapte nervestimulering og responsen fra det likt muskelen fremkalt av direkte stimulering av dets membran foreslått som en indirekte måling av NMJ funksjonalitet. Faktisk siden membranen stimulering by-pass neurotransmission signalering, kan eventuelle forskjeller i de to kontraktile svarene tilskrives endringer i NMJ. Denne tilnærmingen har vært mye foreslått for rotter,3,,4,,5,,6,,7, og også brukes til å samle informasjon om musen modeller8,9,10,11,12.
Her beskrive vi i detalj en prosedyre for å avgiftsdirektoratet og teste to muskel-nerve preparater, IE soleus-ischias og membran-phrenic forberedelsene. Ved hjelp av en skreddersydd programvare, vi utviklet en kontinuerlig testing protokoll som kombinerer måling av flere parametere som preger både NMJ og muskel-funksjonalitet, og dermed gir en omfattende vurdering av NMJ skade separat fra det muskler. Spesielt måler protokollen twitch styrken, muskel kinetikk, kraft-frekvens kurve for direkte og nerve stimulations, den neurotransmission feil13 for både en avfyring og tetanic frekvenser og intratetanic trøtthet7.
Eksperimentell protokollen beskrevet ovenfor gir en ideell måte å måle og diskriminerende alle funksjonelle endringer som har skjedd i muskelen eller indirekte på nevromuskulær krysset nivå. Siden denne teknikken er basert på en indirekte måling av NMJ funksjonalitet, kan det brukes til å opprette hvis noen feil knyttet til morfologiske endringer eller biokjemiske endringer. Derimot, gir den en effektiv måte å avgjøre om noen morfologiske eller biokjemiske endringer har redusert neurotransmission signalering …
The authors have nothing to disclose.
Arbeid i forfatternes laboratorium ble støttet av Fondazione Roma og Telethon (gi nei. GGP14066).
Dual-Mode Lever System | Aurora Scientific Inc. | 300B | actuator/transducer |
High-Power Bi-Phase Stimulator | Aurora Scientific Inc. | 701B | pulse stimulator (nerve) |
High-Power Bi-Phase Stimulator | Aurora Scientific Inc. | 701C | pulse stimulator (muscle) |
In vitro Muscle Apparatus | Aurora Scientific Inc. | 800A | |
Preparatory tissue bath | Radnoti | 158400 | |
Monopolar Suction Electrode | A-M Systems | 573000 | with a home-made reference |
Oscilloscope | Tektronix | TDS2014 | |
Stereomicroscope | Nikon | SMZ 800 | |
Cold light illuminator | Photonic Optics | PL 3000 | |
Acquisition board | National Instruments | NI PCIe-6353 | |
Connector block | National Instruments | NI 2110 | |
Personal computer | AMD Phenom II x4 970 | Processor 3.50 Ghz with Windows 7 | |
LabView 2012 software | National Instruments | ||
Krebs-Ringer Bicarbonate Buffer | Sigma-Aldrich | K4002 | physiological buffer |
Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
Calcium chloride CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | anhydrous, powder, ≥97% |
Potassium dihydrogen phosphate KH₂PO₄ | AnalaR | 7778-77-0 | |
Magnesium sulphate MgSO₄ | AnalaR | 7487-88-9 | |
Buffer HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | ≥99.5% (titration) |
Dishes 60mm x 15mm | Falcon | 353004 | Polystyrene |
Silicone | Sylgard | 184 Silicone | Elastomer Kit 0.5Kg. |
Thermostat | Dennerle | DigitalDuomat 1200 | |
Pump | Newa Mini | MN 606 | for aquarium |
Heat resistance Thermocable | Lucky Reptile | 61403-1 | 50/60Hz 50W |
Bucket | any 10 liters | Polypropylene | |
O2 + 5%CO2 | siad | Mix gas | |
#5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | 2 items |
Spring Scissors – 8 mm Blades | Fine Science Tools | 15024-10 | nerve excision |
Sharp Scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | muscle removal |
Delicate Scissors | Wagner | 02.06.32 | external of the animal |
Student Scalpel Handle #3 | Fine Science Tools | 91003-12 | |
Scalpel Blades #10 | Fine Science Tools | 10010-00 | |
Scalpel Blades #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | |
nylon wire Ø0.16 mm | any |