Einzelzell-RNA-Seq von definierten Subsets von Retinal-Ganglion-Zellen
Summary
Hier präsentieren wir einen kombinatorischen Ansatz zur Klassifizierung von neuronalen Zelltypen vor der Isolierung und für die anschließende Charakterisierung von einzelligen Transkriptomen. Dieses Protokoll optimiert die Probenvorbereitung für eine erfolgreiche RNA-Sequenzierung (RNA-Seq) und beschreibt eine Methodik, die speziell für das verbesserte Verständnis der zellulären Vielfalt entwickelt wurde.
Abstract
Die Entdeckung von zelltypspezifischen Markern kann Einblicke in die zelluläre Funktion und die Ursprünge der zellulären Heterogenität geben. Mit einem jüngsten Push für das verbesserte Verständnis der neuronalen Vielfalt ist es wichtig, Gene zu identifizieren, deren Ausdruck verschiedene Subpopulationen von Zellen definiert. Die Netzhaut dient als hervorragendes Modell für die Untersuchung der zentralen Nervensystem-Vielfalt, da sie aus mehreren Hauptzelltypen besteht. Die Untersuchung jeder Hauptklasse von Zellen hat genetische Marker ergeben, die die Identifizierung dieser Populationen erleichtern. Allerdings gibt es mehrere Subtypen von Zellen innerhalb jeder dieser großen retinalen Zellklassen, und wenige dieser Subtypen haben genetische Marker bekannt, obwohl viele durch Morphologie oder Funktion charakterisiert wurden. Eine Kenntnis von genetischen Markern für einzelne retinale Subtypen würde die Untersuchung und Kartierung von Hirnzielen ermöglichen, die sich auf spezifische visuelle Funktionen beziehen und auch einen Einblick in die Gennetze vermitteln könnenPflegen zelluläre Vielfalt. Die gegenwärtigen Wege, die verwendet wurden, um die genetischen Marker von Subtypen zu identifizieren, besitzen Nachteile, wie die Klassifizierung von Zelltypen nach der Sequenzierung. Dies stellt eine Herausforderung für die Datenanalyse dar und erfordert rigorose Validierungsmethoden, um sicherzustellen, dass Cluster Zellen der gleichen Funktion enthalten. Wir schlagen eine Technik zur Identifizierung der Morphologie und Funktionalität einer Zelle vor der Isolierung und Sequenzierung vor, die eine leichtere Identifizierung von subtypspezifischen Markern ermöglicht. Diese Technik kann auf nicht-neuronale Zelltypen sowie auf seltene Populationen von Zellen mit geringfügigen Variationen erweitert werden. Dieses Protokoll liefert hervorragende Daten, da viele Bibliotheken Lese-Tiefen von mehr als 20 Millionen Lesungen für einzelne Zellen zur Verfügung gestellt haben. Diese Methodik überwindet viele der Hürden, die von Single-Cell RNA-Seq präsentiert werden, und kann für Forscher geeignet sein, die darauf abzielen, Zelltypen auf einfache und hocheffiziente Weise zu profilieren.
Introduction
Die neuronale Diversität wird im gesamten Zentralnervensystem beobachtet, insbesondere in der Wirbeltierhaut, ein hochspezialisiertes Gewebe, bestehend aus 1 glialen und 6 neuronalen Zelltypen, die aus einer Population der Netzhautvorläuferzellen 1 , 2 , 3 entstehen. Viele Subtypen von Zellen können funktionell, morphologisch und genetisch klassifiziert werden. Ziel dieses Protokolls ist es, die genetische Variabilität von Zelltypen an ihre identifizierbaren funktionellen und / oder morphologischen Eigenschaften zu binden. Eine Reihe von Genen wurden für die Klassifizierung von Zellen identifiziert, aber viele Subtypen gehen weiterhin uncharakterisiert, da sie einen kleinen Bruchteil der Gesamtbevölkerung darstellen. Die Identifizierung von Genen innerhalb dieser spezifischen Subtypen wird ein besseres Verständnis der neuronalen Vielfalt innerhalb der Netzhaut ermöglichen und kann auch die Diversifizierung der neuralen Zellen anderswo beleuchten. FuDarüber hinaus erlauben Single-Cell-Studien die Aufdeckung neuer Zelltypen, die aufgrund ihrer geringen Repräsentation unter der Gesamtbevölkerung 4 , 5 , 6 , 7 übersehen werden können .
Einer der Vorteile der Single-Cell-Transkriptomik ist, dass einzigartige Marker oder Kombinationen von Markern, die einen bestimmten zellulären Subtyp definieren, entdeckt werden können. Diese können dann verwendet werden, um genetischen Zugang zu diesem Zelltyp für verschiedene Manipulationen zu gewinnen. Zum Beispiel verwenden wir dieses Protokoll zur Charakterisierung der zelltypspezifischen Gene einer Untergruppe von retinalen Ganglienzellen, die das Photopigment Melanopsin exprimieren. Die Verwendung eines fluoreszierenden Markers in Melanopsin-exprimierenden retinalen Ganglienzellen ermöglicht die Untersuchung dieser Zellen, da sie aufgrund ihrer Expression eines bekannten Gens zusammengehäuft sind. Interessanterweise gibt es fünf bekannte Subtypen dieser Zelle PopuLation in der Maus Retina 8 . Um also RNA aus Zellen jedes Typs zu isolieren, haben wir im Rahmen des transgenen Modells etablierte morphologische Klassifikationen verwendet, um jeden Subtyp vor der Zellisolation zu identifizieren. Diese Technik ermöglicht sowohl die Charakterisierung von Zellen als auch für ihre Isolierung direkt aus der Netzhaut, ohne die Notwendigkeit einer Gewebedissoziation, die eine Stressreaktion innerhalb von Zellen und eine Kontamination aufgrund von abgetrennten Dendriten verursachen kann 9 .
In den vergangenen Jahren ist eine Vielzahl neuer Techniken aufgetaucht, da sich die RNA-Seq-Methode weiterentwickelt. Diese Werkzeuge ermöglichen eine maximierte Zellaufnahme und eine höhere Kosteneffizienz bei Annäherung an die Frage 4 , 7 , 10 , 11 , 12 , 13 . Doch währendDiese Techniken waren hervorragende Stepping-Steine, gibt es eine Reihe von Hürden noch begegnet, dass dieses Protokoll in der Lage ist, Adresse. Zuerst isolieren viele der gegenwärtigen Verfahren Zellen aus dissoziiertem Gewebe und versuchen, entweder Hauptkomponentenanalyse oder hierarchische Clustering Post-hoc zu verwenden, um die Zellklassifizierung zu bestimmen. Das Verlassen auf diese Werkzeuge, um Subtypen zu klassifizieren, kann keine zuverlässigen Ergebnisse liefern und kann dazu führen, dass man neue Wege findet, um diese Daten für die Korrelation eines genetischen Markers zu einem funktionellen Zelltyp zu validieren. Das Erfordernis der Dissoziation in anderen Protokollen kann manchmal zu Gewebeschäden führen und kann dazu führen, dass neuronale Prozesse abgetrennt werden, was zu einem möglichen Verlust an mRNA führt. Weiterhin können in den dissoziierten Zellpräparaten die Stressreaktionen beginnen, die Transkriptome dieser Zellen zu beeinflussen 14 . Dieses Protokoll überwindet diese Herausforderungen durch die Bestimmung der funktionellen Zelltyp vor der Isolierung, und es hält besser die hDie Fähigkeit, das Netzhautgewebe intakt zu halten.
Eine Technik wurde im Jahr 2014 eingeführt und bestand aus der in vivo Analyse des Transkriptoms der lebenden Zellen 15 . Während diese Technik die Untersuchung des Transkriptoms mit minimaler mechanischer Störung des Gewebes ermöglicht, fehlt es an der Fähigkeit, spezifische Zelltypen innerhalb des Gewebes zu klassifizieren, bevor sie ihre Transkriptome untersuchen, ohne eine sehr spezifische Reportermaus zu verwenden. Unser Protokoll erfordert keinen spezifischen Reporter, da wir die Zellfüllung und die Elektrophysiologie nutzen, um Zellen vor ihrer Isolation zu charakterisieren. Eine weitere Einschränkung dieses früheren Protokolls besteht darin, dass es eine spezifische Wellenlänge benötigt, um das photoaktivierbare Element anzuregen, während unser Protokoll die Verwendung eines fluoreszierenden Reporters und eines fluoreszierenden Farbstoffs ermöglicht, die leicht verfügbar sind oder von jedem Labor einzeln ausgewählt werden können. Dennoch haben andere Laboratorien die beiden Methoden der Elektrizität geheiratetOphysiologie und Transkriptomik für das Studium der Zellvielfalt. Die Verwendung von Patch-Clamp-Aufnahmen zur Charakterisierung der Funktion einer Zelle vor ihrer Isolation wurde auf dissoziierten Neuronen durchgeführt 16 und in einigen Fällen ist sie der Verwendung der Mikroarray-Analyse 17 für diese Studien vorausgegangen. Die gleichen Komplikationen treten bei jenen Ansätzen auf, da sie eine Gewebedissoziation oder die Verwendung von Mikroarray-Technologie erfordern, die auf der Hybridisierung von Proben auf verfügbare Sonden beruht. Einer der jüngsten Fortschritte war die Entwicklung von Patch-Seq, einer Technik, die den Einsatz von Patch-Clamp-Aufnahmen und RNA-Seq-Technologie kombiniert, um Zellen aus Ganzhirn-Scheiben zu verstehen. Während diese Technik ihre Ähnlichkeiten mit dem hier vorgestellten Protokoll hat, ist es wieder wichtig zu beachten, dass unser Ansatz es dem Gewebe ermöglicht, für die Gesundheit der Zellen intakt zu bleiben. Hier stellen wir ein Protokoll für die optimizat vorIon dieser Allianz, die qualitativ hochwertige Single-Cell-Bibliotheken für den Einsatz von RNA-Seq generiert, um eine hohe Lesetiefe und Mapping-Abdeckung zu erhalten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Unser Protokoll demonstriert durch eine schnelle und einfach zu bedienende Anleitung eine Methode zur Vorbereitung einzelner Zellen identifizierter morphologischer Klassen für qualitativ hochwertige Sequenzierung mit wenig Verletzung der Probe. In dem vorliegenden Manuskript werden intrinsisch lichtempfindliche retinale Ganglienzellen morphologisch charakterisiert, isoliert und für RNA-Seq vorbereitet. Während der Netzhauthandhabung können zelluläre Spannungen auftreten Aus diesem Grund ersetzen wir jedes Stück Ge…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir möchten Jennifer Bair und Einat Snir sowie das Institut für Humangenetik der Universität Iowa für ihre Unterstützung bei der Vorbereitung und Bearbeitung von Proben anerkennen.
Materials
| Ames' Medium | Sigma Aldrich | A1420-10X1L | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S8875 | |
| K-gluconate | Spectrum Chemical | PO178 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E4378 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Sigma Aldrich | D5758 | |
| Alexa Fluor 594 Hydrazide | Invitrogen | A10442 | |
| Collagenase | Worthington Biochemical | LS005273 | |
| Hyaluronidase | Worthington Biochemical | LS002592 | |
| Petri dish (35mm diameter) | Thermo Fisher Scientific | 153066 | |
| Ophthalmologic scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| Microplate Shaker | Fisher Scientific | 13-687-708 | |
| Glass Micropipette | Sutter | BF120-69-10 | |
| Micropipette Puller | Sutter | P-1000 horizontal pipette puller | |
| 1mL syringe | Fisher Scientific | 14-823-2F | |
| Flexible tubing | Fisher Scientific | 14-171 | |
| TCL lysis buffer | Qiagen | 1031576 | Lysis Buffer 1 |
| β-mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M3148 | |
| RNase-Free Water | Qiagen | 129112 | |
| 0.2 ml PCR tubes | Eppendorf | 30124359 | |
| Ethyl Alcohol, Pure | Sigma Aldrich | E7023 | Ethanol |
| Analog Vortex Mixer | Thermo Fisher Scientific | 02215365 | Vortex |
| Mini Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 05-090-100 | |
| Agencourt RNAClean XP Beads | Beckman Coulter | A63987 | RNA magnetic beads |
| MagnaBlot II Magnetic Separator | Promega | V8351 | Magnetic stand |
| 1.5 ml MCT Graduated Tubes | Thermo Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Smart-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit | Clontech | 634888 | Reagents for Reverse Transcription and PCR Amplification |
| 10X Lysis Buffer | Lysis Buffer 2 | ||
| 5X Ultra Low First-Strand Buffer | Buffer 1 | ||
| 3' SMART-Seq CDS Primer II A | Primer II | ||
| SMART-Seq v4 Oligonucleotide | Oligonucleotide | ||
| SMARTScribe Rverse Transcriptase | Reverse Transcriptase | ||
| 2X SeqAmp PCR Buffer | PCR Buffer | ||
| PCR Primer II A | PCR Primer | ||
| SeqAmp DNA Polymerase | DNA Polymerase | ||
| Mastercycler pro S | Eppendorf | 950030020 | Thermocycler |
| Agencourt AMPure XP Beads | Beckman Coulter | A63881 | DNA magnetic beads |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939AA | |
| HS Bioanalyzer Chips & Reagents | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
| Qubit HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | Q32851 | For the calculation of sample concentrations |
| Qubit Assay Tubes | Thermo Fisher Scientific | Q32856 | |
| Qubit 2.0 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q32866 | |
| Nextera XT DNA Sample Preparation Kit | Illumina | FC-131-1024 | Reagents for Tagmentation and Index Coupling |
| TD Buffer | Buffer 2 | ||
| ATM | Tagmentation Mix | ||
| NT Buffer | Tagmentation Neutralizing Buffer | ||
| NPM | PCR Master Mix | ||
| Nextera XT Index Kit | Illumina | FC-131-1001 | Indices for Tagmentation |
| N501 | White 1 | ||
| N502 | White 2 | ||
| N701 | Orange 1 | ||
| N702 | Orange 2 | ||
| HiSeq 2500 | Illumina | SY-401-2501 | For completing sequencing of samples |
References
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