Kvantificering af Drosophila Grooming Adfærd
Summary
Denne protokol beskriver en skalerbar individuel grooming assay teknik i Drosophila, der giver robuste, kvantitative data til måling af grooming opførsel. Metoden er baseret på at sammenligne forskellen i akkumulering af farvestoffer på kroppen af ikke-preparerede versus dyrede dyr over en bestemt periode.
Abstract
Drosophila grooming adfærd er et komplekst multi-trins lokomotorisk program, der kræver koordineret bevægelse af både forben og bagben. Her præsenterer vi en grooming assay protokol og nyt kammer design, der er omkostningseffektivt og skalerbar til enten små eller store undersøgelser af Drosophila grooming. Fluer er støvet over deres krop med Brilliant Yellow farve og givet tid til at fjerne farvestoffet fra deres kroppe i kammeret. Fluer deponeres derefter i et sæt volumen ethanol for at opløse farvestoffet. Den relative spektralabsorbans af farvestof-ethanolprøver til forplejede versus ungrumsdyr måles og registreres. Protokollen giver kvantitative data om farvestofakkumulering for individuelle fluer, som let kan gennemsnitligt sammenlignes over prøver. Dette gør det muligt for eksperimentelle designs at let vurdere grooming evne til mutant dyreforsøg eller kredsløb manipulationer. Denne effektive procedure er både alsidig og skalerbar. Vi viser wOrk-flow af protokollen og sammenlignende data mellem WT dyr og mutante dyr til Drosophila type I Dopamin Receptor ( DopR ).
Introduction
Grooming i Drosophila melanogaster ( D. melanogaster ) er en robust medfødt adfærd, der involverer koordinering af flere uafhængige motorprogrammer 1 . Frugtflugter renser deres stof af støv, mikrober og andre patogener, som kunne hæmme normal fysiologisk funktion som syn og fly eller føre til betydelige immunforsvar. Ved at føle og reagere på både mekanisk 2 og immunaktivering 3 , flyver fluer gentagne gange deres ben sammen eller på en målrettet kropsregion, indtil den er tilstrækkelig ren, og grooming skrider frem til en anden del af kroppen. Fluer udfører grooming bevægelser i forskellige begivenheder, der stort set forekommer i stereotype mønstre 1 , 4 . Et adfærdsmæssigt hierarki bliver tydeligt, da groomsignaler prioriteres. Kredsløb og aktivitetsmønstre er blevet identificeret i support oFa model, at plejeprogrammer øverst i hierarkiet forekommer først og undertrykker parallelle signaler fra områder af kroppen, der forberedes efterfølgende 5 . Højeste prioritet gives til hovedet, derefter maven, vingerne og til sidst thoraxen 5 .
Plejeprogrammet i D. melanogaster er et ideelt system til undersøgelse af neurale kredsløb, modulerende molekylære signaler og neurotransmittere. For eksempel kompromittering af neurofibrominfunktion 6 , tab af Drosophila fragile X mentalt retardationsprotein ( dfmr1 ) 7 og eksponering for bisfenol A (BPA) 8 forårsager alt for groom pleje og anden adfærd, der er analog med diskrete humane symptomer på neurofibromatose, skrøbelig X Syndrom og aspekter af autismespektrumforstyrrelser og henholdsvis ADHD (Attention-Deficit Hyperactivity Disorder). Grooming opførsel kan også være habituaTed differentielt på tværs af mutante stammer 2 , udlån denne motor program til undersøgelser af adfærdsmæssig plasticitet. Bredden af neurologiske fænomener, der kan modelleres af Drosophila, kræver en ny komparativ tilgang til måling af fluernes evne til at pleje sig selv.
Den kombinerede virkning af vesikulære monoamintransportører og den relative overflod af dopamin og andre biogene aminer i kroppen har vist sig at formidle frugtsluftsplejende adfærd 9 , 10 . Octopamin og dopamin stimulerer sammenlignelig hindleg grooming aktivitet i decapitated fluer, mens tyramin, forløber for octopamin, også udløser pleje i mindre grad 7 . Fire dopaminreceptorer er blevet identificeret i D. melanogaster 11 , 12 , 13 , 14 </sup>. Ved at anvende groomassaymetoden beskrevet i denne protokol bestemte vi en rolle for type I-familien Dopamin Receptor DopR ( DopR, dDA1, dum ) i hindleg grooming adfærd 15 .
Grooming kan indirekte kvantificeres ved at se på omfanget af renlighed, hvormed et dyr helt kan gifte sig efter at støv hele kroppen med et markørfarve eller fluorescerende støv 5 , 16 . Resten af støv tilbage på kroppen kan bruges som en relativ markør for den overordnede opførsel. Dusty flyver efter at have fået tilstrækkelig tid til at gifte sig kan vise sig et specifikt underskud i plejeadfærd. Som grooming undersøgelser er blevet mere omfattende, har protokoller indarbejdet sådanne praksis som halshugning for at tilføje farmakologiske behandlinger på nakkebindende nerver 10 , taktil stimulation af børster for at fremkalde grooming respons 2 ,Og videooptagelse af adfærd 15 . Direkte observation af pleje kan let undersøges ved hjælp af visuel observation og manuelt registrering af frekvens og varighed af specifikke plejehændelser 4 .
Vi har designet et femten brøndkammer, der kan konstrueres med en 3D-printer eller laserskærer, og tegningen er tilgængelig til reproduktion 15 . Designet anvender to sammenføjede centrale plader med åbninger, der er matchet og adskilt af mesh og to yderligere glidende top- og bundplader, hvorfra fluer og / eller farvestof er anbragt. Efter at have ladet støvede fluer tid til at pleje, deponerer vi dem i ethanol for at opløse farvestoffet og måle absorbansen af denne opløsning ved farvets bølgelængde. En pladelæser kan bruges til flere parallelle prøver eller et enkeltlæs spektrofotometer kan anvendes til individuelle prøver. Denne metode minimerer fejlen induceret ved håndtering og alLows for grooming analyser skal køres på en mindre, omkostningseffektiv skala. Denne metode er afledt og modificeret fra de metoder, som pioneret af Julie Simpson og Andrew Seeds, der bruger større plejekamre med varmeelementer til temperaturfølsomme kredsløbsmanipulationer 5 . Den følgende protokol viser kvantificering af grooming af hele kroppen såvel som viser alternative metoder til kvantificering af farvestofakkumulering på individuelle kropsdele. Vi præsenterer også stikprøve sammenligningsdata mellem WT og DopR mutanter, samt metoder til beregning af et simpelt præstationsindeks for plejeadfærd.
Protocol
Representative Results
Discussion
Grooming-analysen er relativt ligetil, men vi vil forsigtige eksperimenter have særlig opmærksomhed på følgende spørgsmål. Vedligeholdelse af en tæt forsegling ved at stramme skruerne på top- og bundpladerne efter introduktion af fluer og farvestoffer er afgørende for reproducerbare resultater. Det strålende gule farvestof er meget fint, og løse led kan tillade tab af farvestoffer fra kammerets kanter. Uregelmæssigheden i farvestofindholdet for hver brønd kunne let smide af grooming-kvantificering, da ikke-…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi ønsker at takke Brian Shepherd, Tat Udomritthiruj, Aaron Willey, Ruby Froom, Elise Pitmon og Rose Hedreen for tidligt arbejde med at teste og etablere denne metodologi og kammerdesign. Vi takker Kelly Tellez og Graham Buchan for at læse og redigere manuskriptet. Vi takker Andrew Seeds og Julie Simpson for deres banebrydende arbejde og deres råd og støtte til at foreslå brugen af Brilliant Yellow Dye (Sigma). Dette arbejde støttes dels af Mary E. Groff Kirurgisk og Medicinsk Research and Education Charitable Trust, Bronfman Science Center og Hellman Fellows Program.
Materials
| High-Flex Tygon PVC Clear Tubing | McMaster-Carr | 5229K54 | ID 1/8", OD 1/4", used with micropipettor tips and mesh to construct mouth aspirators |
| Micropipette tips (1ml and 200ul) | Genesee Scientific | 24-165, 24-150R | |
| Nylon Mesh Screen, 2" x 2.6" | McMaster-Carr | 9318T44 | Used to construct grooming chamber and mouth aspirators |
| Dumont #5 Forceps | Roboz Surgical Instrument | RS-5050 | |
| Brilliant Yellow Dye | Sigma-Aldrich | 201375-25G | we recommend use of nitrile gloves while handling this product |
| Vortexer | Fisher Scientific | 12-812 | set to "touch" |
| Ethanol | Carolina Biological Supply | 86-1282 | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | VWR International | 10025-726 | |
| 0.65 ml microcentrifuge tubes | VWR International | 20170-293 | tubes can be reused with successive assays |
| UV 96 well plate | Corning | 26014017 | |
| BioTek Synergy HTX Platereader | BioTek | need to download catalog to access product number | http://www.biotek.com/products/microplate_detection/synergy_htx_multimode_microplate_reader.html?tab=overview |
| Gen5 Microplate Reader and Imager Software | BioTek | ||
| Microsoft Excel | Microsoft | https://www.microsoftstore.com/store/msusa/en_US/pdp/Excel-2016/productID.323021400?tduid=(65d098c0e83b86c952bdff5b0719c83f)(256380)(2459594)(SRi0yYDlqd0-LI..ql4M2LoZBEhcBljvIA)() | |
| Drosophila Incubator | Tritech | DT2-CIRC-TK | |
| 1/4" acrylic plastic | McMaster-Carr | 8473K341 | |
| 8-32 nuts | McMaster-Carr | 90257A009 | |
| 8-32 x 1" hex cap screws | McMaster-Carr | 92185A199 | the bottom plate needs to be tapped for this size screw |
| 8-32 x 1/2" hex cap screws | McMaster-Carr | 92185A194 | the second plate from the top needs to be tapped |
| 2-56 3/8" flat head phillips machine screws | McMaster-Carr | 91500A088 | these hold the two middle plates together |
| 0.175" ID, 1/4" OD, 0.34" aluminum pipe | McMaster-Carr | 92510A044 | Manufactured in-house; product listed is approximately the same dimensions and should work for size 8 screws. These act as sheaths for the 1" screws and set the hex cap up slightly from the surface of the top plate |
References
- Szebenyi, A. L. Cleaning Behaviour in Drosophila-Melanogaster. Animal. Behaviour. 17, (1969).
- Corfas, G., Dudai, Y. Habituation and dishabituation of a cleaning reflex in normal and mutant Drosophila. J Neurosci. 9 (1), 56-62 (1989).
- Yanagawa, A., Guigue, A. M. A., Marion-Poll, F. Hygienic grooming is induced by contact chemicals in Drosophila melanogaster. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 8, (2014).
- Dawkins, R., Dawkins, M. Hierarchical Organization and Postural Facilitation – Rules for Grooming in Flies. Animal Behaviour. 24 (Nov), 739-755 (1976).
- Seeds, A. M., et al. A suppression hierarchy among competing motor programs drives sequential grooming in Drosophila. Elife. 3, e02951 (2014).
- King, L. B., et al. Neurofibromin Loss of Function Drives Excessive Grooming in Drosophila. G3-Genes Genomes Genetics. 6 (4), 1083-1093 (2016).
- Tauber, J. M., Vanlandingham, P. A., Zhang, B. Elevated Levels of the Vesicular Monoamine Transporter and a Novel Repetitive Behavior in the Drosophila Model of Fragile X Syndrome. Plos One. 6 (11), e27100 (2011).
- Kaur, K., Simon, A. F., Chauhan, V., Chauhan, A. Effect of bisphenol A on Drosophila melanogaster behavior–a new model for the studies on neurodevelopmental disorders. Behav Brain Res. 284, 77-84 (2015).
- Chang, H. Y., et al. Overexpression of the Drosophila vesicular monoamine transporter increases motor activity and courtship but decreases the behavioral response to cocaine. Molecular Psychiatry. 11 (1), 99-113 (2006).
- Yellman, C., Tao, H., He, B., Hirsh, J. Conserved and sexually dimorphic behavioral responses to biogenic amines in decapitated Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (8), 4131-4136 (1997).
- Feng, G. P., et al. Cloning and functional characterization of a novel dopamine receptor from Drosophila melanogaster. Journal of Neuroscience. 16 (12), 3925-3933 (1996).
- Gotzes, F., Balfanz, S., Baumann, A. Primary Structure and Functional-Characterization of a Drosophila Dopamine-Receptor with High Homology to Human D(1/5). Receptors. Receptors & Channels. 2 (2), 131-141 (1994).
- Han, K. A., Millar, N. S., Grotewiel, M. S., Davis, R. L. DAMB, a novel dopamine receptor expressed specifically in Drosophila mushroom bodies. Neuron. 16 (6), 1127-1135 (1996).
- Sugamori, K. S., Demchyshyn, L. L., Mcconkey, F., Forte, M. A., Niznik, H. B. A Primordial Dopamine D1-Like Adenylyl Cyclase-Linked Receptor from Drosophila-Melanogaster Displaying Poor Affinity for Benzazepines. Febs Letters. 362 (2), 131-138 (1995).
- Pitmon, E., et al. The D1 family dopamine receptor, DopR, potentiates hind leg grooming behavior in Drosophila. Genes Brain and Behavior. 15 (3), 327-334 (2016).
- Phillis, R. W., et al. Isolation of mutations affecting neural circuitry required for grooming behavior in Drosophila melanogaster. Génétique. 133 (3), 581-592 (1993).
- Hampel, S., Franconville, R., Simpson, J. H., Seeds, A. M. A neural command circuit for grooming movement control. Elife. 4, e08758 (2015).
- Kays, I., Cvetkovska, V., Chen, B. E. Structural and functional analysis of single neurons to correlate synaptic connectivity with grooming behavior. Nature Protocols. 9 (1), 1-10 (2014).
