Quantification du comportement de toilettage de la drosophile
Summary
Ce protocole décrit une technique de dosage personnalisable évolutive dans Drosophila qui produit des données robustes et quantitatives pour mesurer le comportement de toilettage. La méthode est basée sur la comparaison de la différence dans l'accumulation de colorant sur les corps des animaux non-soignés par rapport aux animaux soignés sur une période de temps déterminée.
Abstract
Le comportement de toilettage de Drosophila est un programme complexe de locomoteurs à plusieurs étapes qui nécessite un mouvement coordonné des membres antérieurs et des pattes arrière. Nous présentons ici un protocole d'analyse de toilettage et un nouveau design de chambre qui est rentable et évolutif pour les études à petite ou grande échelle de toilettage de Drosophila . Les mouches sont répandues dans leur corps avec un colorant Jaune Brillant et ont le temps de retirer le colorant de leur corps dans la chambre. Les mouches sont ensuite déposées dans un volume déterminé d'éthanol pour solubiliser le colorant. L'absorbance spectrale relative des échantillons de colorant-éthanol pour les animaux soignés contre les non-tissés est mesurée et enregistrée. Le protocole fournit des données quantitatives sur l'accumulation de colorant pour les mouches individuelles, qui peuvent être facilement calculées en moyenne et comparées entre les échantillons. Cela permet aux conceptions expérimentales d'évaluer facilement la capacité de toilettage pour les études sur les animaux mutants ou les manipulations de circuits. Cette procédure efficace est à la fois polyvalente et évolutive. Nous montrons wFlux ork du protocole et données comparatives entre des animaux WT et des animaux mutants pour le récepteur Dopamine Drosophila de type I ( DopR ).
Introduction
Toilettage dans Drosophila melanogaster ( D. melanogaster ) est un comportement inné robuste qui implique la coordination de multiples programmes moteurs indépendants 1 . Les mouches des fruits nettoient leurs corps de poussière, microbes et autres agents pathogènes qui pourraient entraver une fonction physiologique normale telle que la vision et le vol, ou conduisent à des défis immunitaires importants. En détectant et en réponse à la fois mécanique 2 et l'activation immunitaire 3 , les mouches se frottent de façon répétitive les jambes ensemble ou sur une région ciblée du corps jusqu'à ce qu'il soit suffisamment propre et que le soin de toilette progresse dans une autre partie du corps. Les mouches effectuent des mouvements de toilettage dans des épisodes distincts qui se produisent principalement dans des motifs stéréotypés 1 , 4 . Une hiérarchie comportementale devient évidente lorsque les signaux de toilettage sont priorisés. Les circuits et les modèles d'activité ont été identifiés en appui oFa modèle que les programmes de toilettage en haut de la hiérarchie se produisent d'abord et supprime les signaux parallèles provenant des zones du corps qui sont préparées par la suite 5 . La plus haute priorité est donnée à la tête, puis à l'abdomen, aux ailes et enfin au thorax 5 .
Le programme de toilettage de D. melanogaster est un système idéal pour l'étude des circuits neuronaux, des signaux moléculaires modulateurs et des neurotransmetteurs. Par exemple, le compromis de la fonction 6 de la neurofibromine, la perte de la protéine de retardement 10 fragile X de Drosophila ( dfmr1 ) 7 et l'exposition au bisphénol A (BPA) 8 provoquent tous des traitements généraux excessifs et d'autres comportements analogues aux symptômes humains discrets de neurofibromatose, fragiles X Le syndrome et les aspects des troubles du spectre autistique et du trouble déficitaire de l'attention avec hyperactivité (TDAH), respectivement. Le comportement de toilettage peut aussi être habituéDérivé de façon différentielle à travers les souches mutantes 2 , prêtant ce programme moteur à des études de plasticité comportementale. L'ampleur des phénomènes neurologiques qui peuvent être modélisés par Drosophila exige une nouvelle approche comparative pour mesurer la capacité des mouches de se toiletter.
L'action combinée des transporteurs de monoamine vésiculaire et l'abondance relative de la dopamine et d'autres amines biogènes dans le corps ont montré que la médiation du comportement de toilettage des mouches des fruits 9 , 10 . L'octopamine et la dopamine stimulent l'activité comparable de toilettage des jambes postérieures dans les mouches décapitées, tandis que la tyramine, le précurseur de l'octopamine, déclenche également un soin moindre 7 . Quatre récepteurs de dopamine ont été identifiés dans D. melanogaster 11 , 12 , 13 , 14 </sup>. En utilisant la méthode de dosage de toilettage décrite dans ce protocole, nous avons déterminé un rôle pour le récepteur de Dopamine de type I DopR ( DopR, dDA1, stupide ) dans le comportement de toilettage des lèvres 15 .
Le soin de toilette peut être quantifié indirectement en examinant l'étendue de la propreté par laquelle un animal peut se toiletter complètement après avoir dépoussiéré le corps entier avec un colorant marqueur ou une poussière fluorescente 5 , 16 . Le reste de la poussière laissée sur le corps peut être utilisé comme marqueur relatif pour le comportement global. Les mouches en poudre après avoir eu suffisamment de temps pour se marier peuvent manifester un déficit spécifique dans le comportement de toilettage. Au fur et à mesure que les enquêtes de toilettage sont devenues plus étendues, les protocoles ont incorporé des pratiques telles que la décapitation pour ajouter des traitements pharmacologiques sur les nerfs conjonctifs du cou 10 , la stimulation tactile des poils pour susciter la réponse au groom 2 ,Et enregistrement vidéo de comportement 15 . L'observation directe du toilettage peut être facilement étudiée en utilisant l'observation visuelle et l'enregistrement manuel de la fréquence et de la durée des événements de toilettage spécifiques 4 .
Nous avons conçu une chambre de toilettage de quinze puits qui peut être construite avec une imprimante 3D ou un coupe-laser, et les modèles de modèles sont disponibles pour la reproduction 15 . La conception utilise deux plaques centrales jointes avec des ouvertures assorties et séparées par un maillage et deux plaques supérieures et inférieures, à partir desquelles les mouches et / ou le colorant sont chargés, respectivement. Après avoir autorisé le temps de mouches à épiler, nous les déposons dans de l'éthanol pour solubiliser le colorant et mesurer l'absorbance de cette solution à la longueur d'onde du colorant. Un lecteur de plaques peut être utilisé pour de multiples échantillons parallèles ou un spectrophotomètre à lecture unique peut être utilisé pour des échantillons individuels. Cette méthode minimise l'erreur induite par la manipulation et alDes tests de toilettage permettant d'exécuter une échelle plus petite et moins coûteuse. Cette méthode est dérivée et modifiée à partir des méthodes mises au point par Julie Simpson et Andrew Seeds, qui utilisent des chambres de toilettage plus grandes avec des éléments chauffants pour des manipulations de circuits sensibles à la température 5 . Le protocole suivant montre la quantification du soin du corps entier ainsi que des méthodes alternatives pour quantifier l'accumulation de colorant sur les parties du corps individuelles. Nous présentons également des exemples de données de comparaison entre les mutants WT et DopR , ainsi que des méthodes pour calculer un indice de performance simple pour le comportement de toilettage.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le test de toilettage est relativement simple, mais nous recommandons aux expérimentateurs d'accorder une attention particulière aux problèmes suivants. Le maintien d'un joint étanche en serrant les vis sur les plaques supérieure et inférieure après l'introduction des mouches et du colorant est essentiel pour des résultats reproductibles. Le colorant Jaune Brilliant est très fin et les joints lâches permettront des pertes de teinture des bords de la chambre. L'irrégularité de la teneur en tei…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous souhaitons remercier Brian Shepherd, Tat Udomritthiruj, Aaron Willey, Ruby Froom, Elise Pitmon et Rose Hedreen pour les premiers travaux de test et d'établissement de cette méthodologie et des conceptions de chambre. Nous remercions Kelly Tellez et Graham Buchan pour la lecture et l'édition du manuscrit. Nous remercions Andrew Seeds et Julie Simpson pour leur travail pionnier et leurs conseils et leur soutien en suggérant l'utilisation de Brilliant Yellow Dye (Sigma). Ce travail est soutenu en partie par le Fonds de bienfaisance en recherche et en éducation médicale et chirurgicale Mary E. Groff, le Bronfman Science Centre et le Hellman Fellows Program.
Materials
| High-Flex Tygon PVC Clear Tubing | McMaster-Carr | 5229K54 | ID 1/8", OD 1/4", used with micropipettor tips and mesh to construct mouth aspirators |
| Micropipette tips (1ml and 200ul) | Genesee Scientific | 24-165, 24-150R | |
| Nylon Mesh Screen, 2" x 2.6" | McMaster-Carr | 9318T44 | Used to construct grooming chamber and mouth aspirators |
| Dumont #5 Forceps | Roboz Surgical Instrument | RS-5050 | |
| Brilliant Yellow Dye | Sigma-Aldrich | 201375-25G | we recommend use of nitrile gloves while handling this product |
| Vortexer | Fisher Scientific | 12-812 | set to "touch" |
| Ethanol | Carolina Biological Supply | 86-1282 | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | VWR International | 10025-726 | |
| 0.65 ml microcentrifuge tubes | VWR International | 20170-293 | tubes can be reused with successive assays |
| UV 96 well plate | Corning | 26014017 | |
| BioTek Synergy HTX Platereader | BioTek | need to download catalog to access product number | http://www.biotek.com/products/microplate_detection/synergy_htx_multimode_microplate_reader.html?tab=overview |
| Gen5 Microplate Reader and Imager Software | BioTek | ||
| Microsoft Excel | Microsoft | https://www.microsoftstore.com/store/msusa/en_US/pdp/Excel-2016/productID.323021400?tduid=(65d098c0e83b86c952bdff5b0719c83f)(256380)(2459594)(SRi0yYDlqd0-LI..ql4M2LoZBEhcBljvIA)() | |
| Drosophila Incubator | Tritech | DT2-CIRC-TK | |
| 1/4" acrylic plastic | McMaster-Carr | 8473K341 | |
| 8-32 nuts | McMaster-Carr | 90257A009 | |
| 8-32 x 1" hex cap screws | McMaster-Carr | 92185A199 | the bottom plate needs to be tapped for this size screw |
| 8-32 x 1/2" hex cap screws | McMaster-Carr | 92185A194 | the second plate from the top needs to be tapped |
| 2-56 3/8" flat head phillips machine screws | McMaster-Carr | 91500A088 | these hold the two middle plates together |
| 0.175" ID, 1/4" OD, 0.34" aluminum pipe | McMaster-Carr | 92510A044 | Manufactured in-house; product listed is approximately the same dimensions and should work for size 8 screws. These act as sheaths for the 1" screws and set the hex cap up slightly from the surface of the top plate |
References
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