כימות של תסיסנית התנהגות Grooming
Summary
פרוטוקול זה מתאר טכניקה assay להרחבה אישית assay בתסיסנית כי התשואות נתונים חזקים, כמותיים כדי למדוד התנהגות הטיפוח. השיטה מבוססת על השוואת ההבדל הצטברות צבע על גופים של חיות מטופחות לעומת מטופח על פני תקופה של זמן.
Abstract
תסמונת הטיפוח ההתנהגות היא מורכבת מורכבים צעד רב תוכנית הדורשת תנועה מתואמת של שתי קדמיות ו hindlegs. כאן אנו מציגים פרוטוקול assay grooming עיצוב קאמרית הרומן כי הוא חסכוני וניתן להרחבה עבור מחקרים קטנים או בקנה מידה גדול של תסיסנית תסיסנית . זבובים מאובקים בכל הגוף שלהם עם צבע צהוב מבריק ניתנה זמן כדי להסיר את הצבע מגופם בתוך החדר. זבובים מופקדים אז בנפח קבוע של אתנול כדי solubilize את הצבע. ספיגה ספקטרלית יחסית של דגימות אתנול לצבוע עבור חיות מטופחות לעומת מטומטמים נמדדים ומתועדים. פרוטוקול התשואות נתונים כמותיים של הצטברות צבע עבור זבובים בודדים, אשר ניתן בקלות ממוצעים לעומת דגימות. זה מאפשר עיצובים ניסיוניים בקלות להעריך יכולת הטיפוח עבור מחקרים בבעלי חיים מוטציה או מניפולציות מעגל. הליך זה יעיל הוא גם צדדי וניתן להרחבה. אנו מראים wזרימת אורק של הפרוטוקול ונתונים השוואתיים בין בעלי חיים WT לבין בעלי חיים מוטנטים עבור סוג תסיסנית אני דופמין קולטן ( DopR ).
Introduction
Grooming ב תסיסנית melanogaster ( ד melanogaster ) היא התנהגות מולדת חזקה הכוללת את התיאום של מספר רב של תוכניות עצמאיות המנוע 1 . פירות זבובים לנקות את גופם של אבק, חיידקים, פתוגנים אחרים שיכולים לעכב תפקוד פיזיולוגי נורמלי כגון חזון הטיסה, או להוביל לאתגרים חיסונית משמעותית. בחישה ובמענה לפעולה מכנית 2 ופעילות חיסונית 3 , זבובים משפשפים שוב ושוב את רגליהם או על אזור גוף ממוקד עד שהוא נקי מספיק והטיפוח מתקדם לחלק אחר של הגוף. זבובים לבצע תנועות grooming ב מובהק bouts כי מתרחשות בעיקר בדפוסים סטריאוטיפיים 1 , 4 . היררכיה התנהגותית מתבהרת כאשר אותות הטיפוח מסודרים לפי סדר עדיפויות. מעגלים ודפוסי פעילות זוהו בתמיכהFa, כי תוכניות הטיפוח בחלק העליון של ההיררכיה להתרחש הראשון לדכא אותות מקבילים מאזורים של הגוף כי הם groomed לאחר מכן 5 . העדיפות הגבוהה ביותר ניתנת לראש, אחר כך את הבטן, כנפיים, ולבסוף את בית החזה 5 .
תוכנית הטיפוח ב- D. melanogaster היא מערכת אידיאלית לחקר מעגלים עצביים, אותות מולקולריים מודולאריים ומעבירים נוירוטרנסמיטריים. לדוגמה, פשרה של תפקוד neurofibromin 6 , אובדן של תסיסנית X חלבונים פיגור שכלי נפשי ( dfmr1 ) 7 , וחשיפה bisphenol A (BPA) 8 כל לגרום להתנהגויות מוגזמות והתנהגויות אחרות אשר מקביל לסימפטומים אנושיים נפרדים של neurofibromatosis, שביר X תסמונת, ואת ההיבטים של הפרעות ספקטרום האוטיזם הפרעת קשב וריכוז Hyperactivity הפרעת (ADHD), בהתאמה. התנהגות Grooming יכול להיות גם הרגלטד דיפרנציאלי על פני זנים מוטציה 2 , ההלוואות זו תוכנית המנוע ללימודי גמישות התנהגותית. רוחב התופעות הנוירולוגיות שניתן לדגם על ידי תסיסנית דורש גישה השוואתית חדשה למדוד את היכולת של זבובים לחתן את עצמם.
הפעולה המשולבת של מובילי monoamine שלפוחית ואת השפע היחסי של דופמין ואמינים ביוגניים אחרים בגוף הוכחו לתווך זבוב פרי התנהגות grooming 9 , 10 . Octopamine ודופאמין לעורר פעילות טיפוח hindleg דומה זבובים ערופים, בעוד טירמין, החומר המוצא לייצור octopamine, תופעל גם טיפוח ובמידה פחותה 7. ארבעה קולטנים דופאמין זוהו ב ד melanogaster 11 , 12 , 13 , 14 </sup> על ידי שימוש בשיטה assay הטיפוח המתואר בפרוטוקול זה, קבענו תפקיד עבור סוג אני משפחה Dopamine קולטן DopR ( DopR, dDA1, מטומטם ) ב hindleg התנהגות grooming 15 .
הטיפוח ניתן לכימות בעקיפין על ידי הסתכלות על מידת הניקיון שבו חיה יכולה לחתוך באופן מלא לאחר אבק לכל הגוף עם צבע סמן או אבק פלואורסצנטי 5 , 16 . שאר שאריות האבק שנותרו על הגוף יכולות לשמש כסמן יחסי להתנהגות הכללית. זבובים מאובקים לאחר שקיבלו מספיק זמן כדי החתן עשוי להיות לידי ביטוי גירעון מסוים בהתנהגות grooming. כמו חקירות הטיפוח הפכו נרחב יותר, פרוטוקולים שולבו פרקטיקות כגון עריפת ראש כדי להוסיף טיפולים תרופתי על הצוואר עצבי החיבור 10 , גירוי מישוש של זיפים כדי לעורר את התגובה grooming 2 ,והקלטת וידאו של התנהגות 15 . תצפית ישירה של הטיפוח ניתן ללמוד בקלות באמצעות תצפית חזותית הקלטה ידנית של תדירות ומשך של אירועים grooming ספציפיים 4 .
עיצבנו חמישה עשר חדרים grooming כי ניתן לבנות עם מדפסת 3D או חותך לייזר, ואת עיצובים תכנית מתאר זמינים עבור רבייה 15 . העיצוב משתמש בשני לוחות מרכזיים מחוברים עם פתחים מתאימים מופרדים על ידי רשת ושני לוחות הזזה העליון והתחתון, שממנו זבובים ו / או צבע נטען, בהתאמה. לאחר המאפשרים זבובים אבק זמן החתן, אנו להפקיד אותם אתנול כדי solubilize לצבוע ולמדוד את ספיגת של פתרון זה באורך גל של צבע. קורא צלחת ניתן להשתמש בדגמים מקבילים מרובים או ספקטרופוטומטר יחיד לקרוא ניתן להשתמש עבור דגימות בודדות. שיטה זו ממזער את השגיאה המושרה על ידי טיפול אלLows עבור grooming assays להיות לרוץ על קטן, חסכונית בקנה מידה. שיטה זו נגזרת ו שונה מן השיטות חלוץ על ידי ג 'ולי סימפסון אנדרו זרעים, אשר משתמשים בתאי grooming גדול עם אלמנטים חימום עבור מניפולציות מעגל טמפרטורה רגישה 5 . פרוטוקול הבא מציג את כימות של הטיפוח של הגוף כולו, כמו גם מראה שיטות חלופיות quantitation של הצטברות צבע על חלקי גוף בודדים. כמו כן, אנו מציגים נתוני השוואה מדגם בין מוטציות WT ו- DopR , כמו גם שיטות לחישוב מדד ביצועים פשוט להתנהגות הטיפוח.
Protocol
Representative Results
Discussion
Assay הטיפוח הוא פשוט יחסית, אבל היינו הזהיר הניסויים להקדיש תשומת לב מיוחדת בנושאים הבאים. שמירה על חותם הדוק על ידי הידוק הברגים על צלחות העליון והתחתון לאחר החדרת זבובים וצבע הוא חיוני עבור תוצאות לשחזור. צבע צהוב מבריק הוא מאוד בסדר המפרקים רופפת יאפשר הפסדים של צבע…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו רוצים להודות בריאן שפרד, טאט אודומריטרוג'רוג, אהרון ויללי, רובי פרום, אליס פיטמון, ורד הדרין לעבודה מוקדמת בבדיקות והקמת מתודולוגיה זו עיצובים קאמריים. אנו מודים לקלי טלז ולגרהם בוקאן על קריאה ועריכה של כתב היד. אנו מודים אנדרו זרעים וג 'ולי סימפסון על העבודה החלוצית שלהם ואת העצה שלהם ואת התמיכה בהצעה להשתמש Brilliant צהוב Dye (Sigma). עבודה זו נתמכת בין השאר על ידי מרי א 'גרוף כירורגית מחקר רפואי קרן חינוך, מרכז המדע ברונפמן, ואת תוכנית עמיתי הלמן.
Materials
| High-Flex Tygon PVC Clear Tubing | McMaster-Carr | 5229K54 | ID 1/8", OD 1/4", used with micropipettor tips and mesh to construct mouth aspirators |
| Micropipette tips (1ml and 200ul) | Genesee Scientific | 24-165, 24-150R | |
| Nylon Mesh Screen, 2" x 2.6" | McMaster-Carr | 9318T44 | Used to construct grooming chamber and mouth aspirators |
| Dumont #5 Forceps | Roboz Surgical Instrument | RS-5050 | |
| Brilliant Yellow Dye | Sigma-Aldrich | 201375-25G | we recommend use of nitrile gloves while handling this product |
| Vortexer | Fisher Scientific | 12-812 | set to "touch" |
| Ethanol | Carolina Biological Supply | 86-1282 | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | VWR International | 10025-726 | |
| 0.65 ml microcentrifuge tubes | VWR International | 20170-293 | tubes can be reused with successive assays |
| UV 96 well plate | Corning | 26014017 | |
| BioTek Synergy HTX Platereader | BioTek | need to download catalog to access product number | http://www.biotek.com/products/microplate_detection/synergy_htx_multimode_microplate_reader.html?tab=overview |
| Gen5 Microplate Reader and Imager Software | BioTek | ||
| Microsoft Excel | Microsoft | https://www.microsoftstore.com/store/msusa/en_US/pdp/Excel-2016/productID.323021400?tduid=(65d098c0e83b86c952bdff5b0719c83f)(256380)(2459594)(SRi0yYDlqd0-LI..ql4M2LoZBEhcBljvIA)() | |
| Drosophila Incubator | Tritech | DT2-CIRC-TK | |
| 1/4" acrylic plastic | McMaster-Carr | 8473K341 | |
| 8-32 nuts | McMaster-Carr | 90257A009 | |
| 8-32 x 1" hex cap screws | McMaster-Carr | 92185A199 | the bottom plate needs to be tapped for this size screw |
| 8-32 x 1/2" hex cap screws | McMaster-Carr | 92185A194 | the second plate from the top needs to be tapped |
| 2-56 3/8" flat head phillips machine screws | McMaster-Carr | 91500A088 | these hold the two middle plates together |
| 0.175" ID, 1/4" OD, 0.34" aluminum pipe | McMaster-Carr | 92510A044 | Manufactured in-house; product listed is approximately the same dimensions and should work for size 8 screws. These act as sheaths for the 1" screws and set the hex cap up slightly from the surface of the top plate |
References
- Szebenyi, A. L. Cleaning Behaviour in Drosophila-Melanogaster. Animal. Behaviour. 17, (1969).
- Corfas, G., Dudai, Y. Habituation and dishabituation of a cleaning reflex in normal and mutant Drosophila. J Neurosci. 9 (1), 56-62 (1989).
- Yanagawa, A., Guigue, A. M. A., Marion-Poll, F. Hygienic grooming is induced by contact chemicals in Drosophila melanogaster. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 8, (2014).
- Dawkins, R., Dawkins, M. Hierarchical Organization and Postural Facilitation – Rules for Grooming in Flies. Animal Behaviour. 24 (Nov), 739-755 (1976).
- Seeds, A. M., et al. A suppression hierarchy among competing motor programs drives sequential grooming in Drosophila. Elife. 3, e02951 (2014).
- King, L. B., et al. Neurofibromin Loss of Function Drives Excessive Grooming in Drosophila. G3-Genes Genomes Genetics. 6 (4), 1083-1093 (2016).
- Tauber, J. M., Vanlandingham, P. A., Zhang, B. Elevated Levels of the Vesicular Monoamine Transporter and a Novel Repetitive Behavior in the Drosophila Model of Fragile X Syndrome. Plos One. 6 (11), e27100 (2011).
- Kaur, K., Simon, A. F., Chauhan, V., Chauhan, A. Effect of bisphenol A on Drosophila melanogaster behavior–a new model for the studies on neurodevelopmental disorders. Behav Brain Res. 284, 77-84 (2015).
- Chang, H. Y., et al. Overexpression of the Drosophila vesicular monoamine transporter increases motor activity and courtship but decreases the behavioral response to cocaine. Molecular Psychiatry. 11 (1), 99-113 (2006).
- Yellman, C., Tao, H., He, B., Hirsh, J. Conserved and sexually dimorphic behavioral responses to biogenic amines in decapitated Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (8), 4131-4136 (1997).
- Feng, G. P., et al. Cloning and functional characterization of a novel dopamine receptor from Drosophila melanogaster. Journal of Neuroscience. 16 (12), 3925-3933 (1996).
- Gotzes, F., Balfanz, S., Baumann, A. Primary Structure and Functional-Characterization of a Drosophila Dopamine-Receptor with High Homology to Human D(1/5). Receptors. Receptors & Channels. 2 (2), 131-141 (1994).
- Han, K. A., Millar, N. S., Grotewiel, M. S., Davis, R. L. DAMB, a novel dopamine receptor expressed specifically in Drosophila mushroom bodies. Neuron. 16 (6), 1127-1135 (1996).
- Sugamori, K. S., Demchyshyn, L. L., Mcconkey, F., Forte, M. A., Niznik, H. B. A Primordial Dopamine D1-Like Adenylyl Cyclase-Linked Receptor from Drosophila-Melanogaster Displaying Poor Affinity for Benzazepines. Febs Letters. 362 (2), 131-138 (1995).
- Pitmon, E., et al. The D1 family dopamine receptor, DopR, potentiates hind leg grooming behavior in Drosophila. Genes Brain and Behavior. 15 (3), 327-334 (2016).
- Phillis, R. W., et al. Isolation of mutations affecting neural circuitry required for grooming behavior in Drosophila melanogaster. Génétique. 133 (3), 581-592 (1993).
- Hampel, S., Franconville, R., Simpson, J. H., Seeds, A. M. A neural command circuit for grooming movement control. Elife. 4, e08758 (2015).
- Kays, I., Cvetkovska, V., Chen, B. E. Structural and functional analysis of single neurons to correlate synaptic connectivity with grooming behavior. Nature Protocols. 9 (1), 1-10 (2014).
