ड्रोसोफिला ग्रूमिंग व्यवहार की मात्रा
Summary
इस प्रोटोकॉल में ड्रोसोफिला में एक स्केलेबल व्यक्तिगत सौंदर्य परख तकनीक का वर्णन किया गया है जो सौंदर्य के व्यवहार को मापने के लिए मजबूत, मात्रात्मक डेटा पैदा करता है। इस पद्धति का समय निर्धारित अवधि में गैर-व्युत्पन्न बनाम तैयार पशुओं के शरीर पर डाई संचय में अंतर की तुलना करने पर आधारित है।
Abstract
ड्रोसोफिला संवारने का व्यवहार एक जटिल बहु-कदम वाला चालन कार्यक्रम है जिसके लिए दोनों अग्रगमन और हिंदगैल के समन्वय की आवश्यकता होती है। यहां हम ड्रॉसोफिला के सौंदर्य के छोटे या बड़े पैमाने पर अध्ययन के लिए लागत-कुशल और स्केलेबल युक्त एक सौंदर्यीकरण प्रोटोकॉल और उपन्यास कक्ष डिजाइन प्रस्तुत करते हैं। मक्खियों को अपने शरीर के ऊपर उज्ज्वल पीले डाई के साथ धूसर कर दिया जाता है और चैम्बर के भीतर अपने शरीर से डाई हटाने के लिए समय दिया जाता है। डाई को सुलझाने के लिए मक्खियों को इथेनॉल के एक सेट वॉल्यूम में जमा किया जाता है। अपर्याप्त बनाम बेवकूफ जानवरों के लिए डाई-एथेनॉल नमूनों का सापेक्षिक वर्णक्रमीय अवशोषण मापा जाता है और रिकॉर्ड किया जाता है। प्रोटोकॉल अलग-अलग मक्खियों के लिए डाई संचय के मात्रात्मक आंकड़े पैदा करता है, जो आसानी से औसत और नमूनों में तुलना की जा सकती है। यह प्रायोगिक डिजाइनों को उत्परिवर्ती पशु अध्ययनों या सर्किट जोड़तोड़ के लिए सौंदर्य क्षमता का आसानी से मूल्यांकन करने की अनुमति देता है। यह कुशल प्रक्रिया बहुमुखी और स्केलेबल दोनों है। हम डब्ल्यू दिखाड्रोसोफिला प्रकार I डोपामाइन रिसेप्टर ( डीओपीआर ) के लिए प्रोटोकॉल का ओर्क-फ्लो और डब्ल्यूटीई जानवरों और उत्परिवर्ती जानवरों के बीच तुलनात्मक डेटा।
Introduction
ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर ( डी। मेलेनोगस्टर ) में सौंदर्य एक मजबूत जन्मजात व्यवहार है जिसमें कई स्वतंत्र मोटर कार्यक्रमों के समन्वयन शामिल है 1 । फलों ने धूल, रोगाणुओं और अन्य रोगजनकों के शरीर को साफ किया है जो दृष्टि और उड़ान जैसे सामान्य शारीरिक कार्य को रोक सकते हैं, या महत्वपूर्ण प्रतिरक्षा चुनौतियां पैदा कर सकते हैं। संवेदन और दोनों यांत्रिक 2 का जवाब देने और प्रतिरक्षा सक्रियण 3 में, बार-बार उनके पैरों को एक साथ या एक लक्षित शरीर के क्षेत्र पर रगड़ना मक्खियों जब तक यह पर्याप्त रूप से साफ है और संवारने शरीर के दूसरे हिस्से की प्रगति। मक्खियों अलग-अलग मुकाबले में सौंदर्य आंदोलनों प्रदर्शन करते हैं जो बड़े पैमाने पर टकसाली पैटर्न 1 , 4 में होते हैं । एक व्यवहार पदानुक्रम स्पष्ट हो जाता है क्योंकि संकेतों को प्राथमिकता दी जाती है। सर्किट और गतिविधि के पैटर्न को समर्थन में पहचान की गई है oएफए मॉडल है कि पदानुक्रम के शीर्ष पर सौंदर्य कार्यक्रम पहले पाए जाते हैं और शरीर के उन क्षेत्रों से समानांतर संकेतों को दबा देते हैं जो बाद में 5 तैयार किए जाते हैं। सर्वोच्च प्राथमिकता सिर को दी जाती है, फिर पेट, पंख, और आखिर में छाती 5 ।
डी। मेलेनोगास्टर में सौंदर्य कार्यक्रम न्यूरल सर्किट, मॉंड्युलेटरी आणविक संकेतों और न्यूरोट्रांसमीटर का अध्ययन करने के लिए एक आदर्श प्रणाली है। उदाहरण के लिए, न्यूरॉफिब्रोमिन फंक्शन 6 , ड्रोसोफिला नाजुक एक्स मानसिक मंदता प्रोटीन ( डीएफएमआर 1 ) 7 की हानि , और बिस्फेनोल ए (बीपीए) 8 के संपर्क में होने के कारण सभी अत्यधिक संवारने और अन्य व्यवहार जो न्यूरॉफिब्रोमैटिस के असतत मानव लक्षणों के समान हैं, नाजुक एक्स सिंड्रोम, और आत्मकेंद्रित स्पेक्ट्रम विकार और ध्यान-घाटे सक्रियता विकार (एडीएचडी) के पहलू, क्रमशः। सौंदर्य व्यवहार भी आदत हो सकता हैउत्परिवर्ती उपभेदों में भिन्न रूप से टेड 2 , व्यवहार मोटर के अध्ययन के लिए इस मोटर कार्यक्रम को उधार दे। ड्रोसोफिला द्वारा मॉड्यूलन किए जा सकने वाली न्यूरोलॉजिकल घटनाओं की चौड़ाई में खुद को तैयार करने के लिए मक्खियों की क्षमता को मापने के लिए एक उपन्यास तुलनात्मक दृष्टिकोण की मांग होती है।
वेश्युलर मोनोमोना ट्रांसपोर्टरों की संयुक्त कार्रवाई और शरीर में डोपामाइन और अन्य बायोजेनिक अमीनों के रिश्तेदार बहुतायत से फल की सफाई 9 , 10 के बीच उड़ान भरने के लिए दिखाया गया है। ऑक्टापामाइन और डोपामाइन decapitated मक्खियों में तुलनीय hindleg सौंदर्य गतिविधि को उत्तेजित करते हैं, जबकि tyramine, octopamine के अग्रदूत, भी कम सीमा 7 को संवारने triggers। डी। मेलेनोगास्टर 11 , 12 , 13 , 14 में चार डोपामिन रिसेप्टर्स की पहचान की गई है </sup>। इस प्रोटोकॉल में वर्णित सौंदर्य परख पद्धति का उपयोग करते हुए हमने टाइप 1 परिवार डोपामाइन रिसेप्टर डोपआर ( डोपआर, डीडीए 1, गूंगा ) के लिए एक भूमिका निभाई है, जो कि 15 वीं शल्य चिकित्सा के लिए तैयार है।
सफाई परोक्ष रूप से सफाई की मात्रा को देखकर मात्रा निर्धारित किया जा सकता है जिसके द्वारा एक जानवर पूरी तरह से एक मार्कर डाई या फ्लोरोसेंट धूल 5 , 16 के साथ पूरे शरीर को धूल करने के बाद दूल्हे से दूषित कर सकता है। शरीर पर छोड़ दिया धूल का शेष समग्र व्यवहार के लिए रिश्तेदार मार्कर के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। दुल्हन के लिए पर्याप्त समय दिए जाने के बाद डस्टी मक्खियों को व्यवहार को संतुलित करने में विशिष्ट घाटे को प्रकट किया जा सकता है। के रूप में संवारने जांच और अधिक व्यापक हो गए हैं, प्रोटोकॉल गर्दन संयोजी नसों 10 पर औषधीय उपचार जोड़ने के लिए कत्ल के रूप में इस तरह के व्यवहार को शामिल किया है, बाल के स्पर्श उत्तेजना संवारने प्रतिक्रिया 2 प्रकाश में लाना,और व्यवहार 15 की वीडियो रिकॉर्डिंग संवारने का प्रत्यक्ष अवलोकन आसानी से दृश्य अवलोकन का उपयोग कर और मैन्युअल रूप से आवृत्ति और विशिष्ट सौंदर्य घटनाओं 4 की अवधि रिकॉर्डिंग द्वारा अध्ययन किया जा सकता है।
हमने एक पंद्रह अच्छी तरह के सौंदर्य कक्ष बनाया है जिसे 3 डी प्रिंटर या लेजर कटर के साथ बनाया जा सकता है और ब्लूप्रिंट डिज़ाइन प्रजनन 15 के लिए उपलब्ध हैं। यह डिज़ाइन क्रमशः मक्खियों और / या डाई लोड किए जाने वाले दो से अधिक मध्यवर्ती प्लेट्स का उपयोग करता है, जो मैचों से मेल खाते हैं और अलग-अलग जाल और दो अतिरिक्त स्लाइडिंग शीर्ष और नीचे की प्लेटें हैं। दूषित मक्खियों को दूषित करने की अनुमति देने के बाद, हम डाई के तरंग दैर्ध्य पर डाई को हल करने और इस समाधान के शोषक को मापने के लिए उन्हें इथेनॉल में जमा करते हैं। अलग-अलग नमूनों के लिए एक प्लेट रीडर का उपयोग किया जा सकता है, एक से अधिक समानांतर नमूनों या एकल-पढ़े हुए स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का इस्तेमाल किया जा सकता है। इस विधि से निपटने और अल द्वारा प्रेरित त्रुटि को कम करता हैछोटे, लागत प्रभावी स्केल पर चलाने के लिए एलेक्स को तैयार करने के लिए चढ़ाव यह विधि जूली सिम्पसन और एंड्रयू सीड्स द्वारा विकसित तरीके से प्राप्त की गई है, जो तापमान संवेदनशील सर्किट जोड़तोड़ 5 के लिए ताप तत्वों के साथ बड़े सौंदर्य कक्ष का उपयोग करते हैं। निम्नलिखित प्रोटोकॉल पूरे शरीर को संवारने की मात्रा का विवरण देता है और व्यक्तिगत शरीर के अंगों पर डाई संचय के मात्रा के लिए वैकल्पिक तरीकों को दिखा रहा है। हम WT और DopR म्यूटेंट्स के बीच नमूना तुलना डेटा भी प्रस्तुत करते हैं, साथ ही साथ व्यवहार को सुचारू बनाने के लिए एक साधारण प्रदर्शन इंडेक्स की गणना के तरीकों के लिए।
Protocol
Representative Results
Discussion
सौंदर्य परख अपेक्षाकृत सरल है, लेकिन हम प्रयोगकर्ताओं को निम्न मुद्दों पर विशेष ध्यान देने के लिए सावधानी बरतें। मक्खियों को शुरू करने के बाद शीर्ष और नीचे की प्लेटों पर शिकंजा को कस कर तंग सील बनाए रख…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम इस कार्यप्रणाली और चैम्बर डिज़ाइनों के परीक्षण और स्थापना में प्रारंभिक कार्य के लिए ब्रायन शेफर्ड, तत उदमुतथिरुज, हारून विली, रूबी फूम, एलिस पिटमन, और रोज हेदरिन को धन्यवाद देना चाहते हैं। पांडुलिपि पढ़ने और संपादित करने के लिए हम केली टेललेज़ और ग्राहम बुकन को धन्यवाद देते हैं। हम एंड्रयू सीड्स और जूली सिम्पसन को उनके अग्रणी काम के लिए और उनकी सलाह और समर्थन के लिए धन्यवाद करते हैं, जो कि शानदार पीला डाई (सिग्मा) का इस्तेमाल करते हैं। यह काम मैरी ई। ग्रॉफ सर्जिकल एंड मेडिकल रिसर्च एंड एजुकेशन चैरिटेबल ट्रस्ट, ब्रॉन्फ़मैन साइंस सेंटर और हेलमैन फैलो प्रोग्राम द्वारा भाग में समर्थित है।
Materials
| High-Flex Tygon PVC Clear Tubing | McMaster-Carr | 5229K54 | ID 1/8", OD 1/4", used with micropipettor tips and mesh to construct mouth aspirators |
| Micropipette tips (1ml and 200ul) | Genesee Scientific | 24-165, 24-150R | |
| Nylon Mesh Screen, 2" x 2.6" | McMaster-Carr | 9318T44 | Used to construct grooming chamber and mouth aspirators |
| Dumont #5 Forceps | Roboz Surgical Instrument | RS-5050 | |
| Brilliant Yellow Dye | Sigma-Aldrich | 201375-25G | we recommend use of nitrile gloves while handling this product |
| Vortexer | Fisher Scientific | 12-812 | set to "touch" |
| Ethanol | Carolina Biological Supply | 86-1282 | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | VWR International | 10025-726 | |
| 0.65 ml microcentrifuge tubes | VWR International | 20170-293 | tubes can be reused with successive assays |
| UV 96 well plate | Corning | 26014017 | |
| BioTek Synergy HTX Platereader | BioTek | need to download catalog to access product number | http://www.biotek.com/products/microplate_detection/synergy_htx_multimode_microplate_reader.html?tab=overview |
| Gen5 Microplate Reader and Imager Software | BioTek | ||
| Microsoft Excel | Microsoft | https://www.microsoftstore.com/store/msusa/en_US/pdp/Excel-2016/productID.323021400?tduid=(65d098c0e83b86c952bdff5b0719c83f)(256380)(2459594)(SRi0yYDlqd0-LI..ql4M2LoZBEhcBljvIA)() | |
| Drosophila Incubator | Tritech | DT2-CIRC-TK | |
| 1/4" acrylic plastic | McMaster-Carr | 8473K341 | |
| 8-32 nuts | McMaster-Carr | 90257A009 | |
| 8-32 x 1" hex cap screws | McMaster-Carr | 92185A199 | the bottom plate needs to be tapped for this size screw |
| 8-32 x 1/2" hex cap screws | McMaster-Carr | 92185A194 | the second plate from the top needs to be tapped |
| 2-56 3/8" flat head phillips machine screws | McMaster-Carr | 91500A088 | these hold the two middle plates together |
| 0.175" ID, 1/4" OD, 0.34" aluminum pipe | McMaster-Carr | 92510A044 | Manufactured in-house; product listed is approximately the same dimensions and should work for size 8 screws. These act as sheaths for the 1" screws and set the hex cap up slightly from the surface of the top plate |
References
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