Drosophila 그루밍 행동의 부량
Summary
이 프로토콜은 미용 행동을 측정하기위한 견고하고 정량적 인 데이터를 산출하는 Drosophila 의 확장 가능한 개별 그루밍 분석 기술을 설명합니다. 이 방법은 일정 기간 동안 비 – 손질 된 동물의 몸에 염료 축적의 차이를 비교하는 것에 기초합니다.
Abstract
Drosophila 손질 행동은 앞다리와 뒷다리의 조율 된 움직임을 필요로하는 복잡한 다단계 이동 모터 프로그램입니다. 여기에 우리는 Drosophila 그루밍의 작거나 큰 규모의 연구를 위해 비용 효율적이고 확장 가능한 미용 분석 프로토콜과 새로운 챔버 디자인을 제시합니다. 파리는 브릴리언트 옐로우 (Brilliant Yellow) 염료를 사용하여 몸 전체에 뿌려지며 챔버 내에서 몸에서 염료를 제거 할 시간이 주어집니다. 파리는 염료를 용해시키기 위해 일정량의 에탄올에 침전됩니다. 손질되지 않은 동물에 대한 염료 – 에탄올 샘플의 상대 분광 흡광도가 측정되고 기록됩니다. 이 프로토콜은 개개의 파리에 대한 염료 축적의 정량적 데이터를 산출하며, 이는 샘플을 통해 쉽게 평균화되고 비교 될 수 있습니다. 이를 통해 실험 설계가 돌연변이 동물 연구 또는 회로 조작을위한 손질 능력을 쉽게 평가할 수 있습니다. 이 효율적인 절차는 다양하고 확장 가능합니다. 우리는 w를 보여준다.Drosophila type I Dopamine Receptor ( DopR )에 대한 WT 동물과 돌연변이 동물 사이의 프로토콜 및 비교 데이터의 ork-flow.
Introduction
Drosophila melanogaster ( D. melanogaster )의 정리는 여러 독립 모터 프로그램의 조정을 포함하는 견고한 타고난 행동입니다 1 . 과일 파리는 먼지, 미생물 및 시력과 같은 정상적인 생리 기능을 억제하거나 심각한 면역 장애를 일으킬 수있는 다른 병원체를 청소합니다. 기계 2 와 면역 활성화 3 을 감지하고 반응 할 때, 파리는 충분히 깨끗하고 몸의 다른 부위로 갈아 엎기 전까지 다리를 함께 또는 대상 신체 부위에 반복적으로 문지릅니다. 파리는 틀에 박힌 패턴 1 , 4 에서 크게 발생하는 뚜렷한 관찰에서 손질 동작을 수행합니다. 그루밍 신호가 우선시 될 때 행동 계층이 분명해진다. 회로 및 활동 패턴이 지원에서 확인되었습니다.계층의 최상 정리 프로그램이어서 5 단정되는 신체 부위에서 병렬 신호를 발생하고 제 억제 FA 모델. 가장 우선 순위가 머리에 주어진 다음 복부, 날개 및 마지막으로 흉부 5 .
D. melanogaster 의 미용 프로그램은 신경 회로, 조절 분자 신호 및 신경 전달 물질을 연구하기위한 이상적인 시스템입니다. 예를 들어 뉴로 파이브 로민 기능 6 의 손상, Drosophila fragile X 정신 지체 단백질 ( dfmr1 ) 7의 손실 및 bisphenol A (BPA) 8 노출은 모두 신경 섬유종증의 개별 인간 증상과 유사한 과도한 손질 및 기타 행동을 일으키고, 연약 X 증후군, 자폐 스펙트럼 장애 및 주의력 결핍 과잉 행동 장애 (ADHD)의 양상을 보였다. 정리 행동은 또한 habitua 수 있습니다테드 차별적 행동 소성의 연구로이 운동 프로그램을 빌려주는 돌연변이 균주 2에서. Drosophila에 의해 모델화 될 수있는 신경 현상의 범위는 파리의 스스로를 손질하는 능력을 측정하기위한 새로운 비교 접근법을 요구합니다.
소포 성 모노 아민 전달체와 도파민 및 기타 생체 아민의 체내에서의 상대적 작용은 과실 파리루 행동을 중재하는 것으로 나타났습니다 9 , 10 . 티라민, 옥토 파민의 전구체는, 또한 적게 7에 정리 트리거 동안 옥토 파민 도파민은 참수 파리에 필적 뒷다리 손질 활성을 자극한다. 4 개의 도파민 수용체가 D. melanogaster 11 , 12 , 13 , 14 </sup>. 이 프로토콜에서 설명하는 그루밍 분석 방법을 사용함으로써, 우리는 (15) 동작을 정리 유형 I 군 도파민 수용체 DopR (벙어리 DopR, dDA1) 뒷다리에서의 역할을 결정 하였다.
그루밍은 마커 염료 또는 형광 분진으로 동물 전체를 털어 내고 나서 동물이 완전히 손질 할 수있는 청결 정도를 간접적으로 계량하여 측정 할 수 있습니다 5 , 16 . 신체에 남아있는 먼지의 나머지 부분은 전반적인 행동에 대한 상대적 마커로 사용할 수 있습니다. 신랑에게 충분한 시간을 준 후에 더스티 파리는 몸단결 행동에있어서 특정한 적자를 나타낼 수 있습니다. 손질 조사가 더욱 광범위 해짐에 따라, 프로토콜은 목 결합 신경 ( 10) 에 약리학 적 치료를 추가하기위한 목을 베는 것, 손질에 대한 반응을 이끌어 내기 위해 촉각 자극을주는 것 ( 2 )행동의 비디오 녹화 15 . 미용 관찰의 직접 관찰은 시각적 관찰을 사용하고 특정 미용 이벤트의 빈도 및 기간을 수동으로 기록하여 쉽게 연구 할 수 있습니다 4 .
우리는 3D 프린터 또는 레이저 커터로 제작할 수있는 15 개의 그루밍 챔버를 설계했으며, 청사진 디자인은 복제를 위해 사용할 수 있습니다 15 . 이 디자인은 두 개의 합쳐진 중심 판을 사용하여 매쉬로 매칭되고 분리 된 구멍과 2 개의 추가 슬라이딩 상단 및 하단 판을 사용하여 파리 및 / 또는 염료가 각각 적재됩니다. 분진이 날아 오르는 것을 허용 한 후에는 에탄올에 넣어서 염료를 용해시키고 염료의 파장에서이 용액의 흡광도를 측정합니다. 플레이트 판독기는 여러 개의 병렬 샘플에 사용할 수 있으며 단일 판독 분광 광도계는 개별 샘플에 사용할 수 있습니다. 이 방법은 핸들링으로 인한 오류를 최소화하고더 작고 비용 효율적인 규모로 시험 분석을 수행 할 수 있습니다. 이 방법은 줄리 심슨 (Julie Simpson)과 앤드류 시드 (Andrew Seeds)가 개척 한 방법으로 온도에 민감한 회로 조작을위한 가열 요소가있는 더 큰 그루밍 챔버를 사용하여 파생 및 수정되었습니다 5 . 다음 프로토콜은 전신의 몸단장을 정량화하고 개별 신체 부위에 염료 축적을 정량화하는 대체 방법을 보여줍니다. 우리는 또한 WT와 DopR 돌연변이 사이의 표본 비교 데이터와 그루밍 행동에 대한 간단한 성과 지표를 계산하는 방법을 제시합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
미용 분석은 비교적 간단하지만 다음과 같은 문제에 특별한주의를 기울여야합니다. 플라이와 염료를 넣은 후 위쪽과 아래쪽 판에 나사를 조여 단단히 밀폐 된 상태로 유지하는 것은 재현성있는 결과를 위해 필수적입니다. 브릴리언트 옐로우 염료는 매우 미세하며 느슨한 관절은 챔버의 가장자리에서 염료가 손실되는 것을 허용합니다. 각 우물에 대한 염료 함량의 불규칙성으로 인해 불균일 한 ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 Brian Shepherd, Tat Udomritthiruj, Aaron Willey, Ruby Froom, Elise Pitmon, Rose Hedreen에게이 방법론과 챔버 디자인을 테스트하고 확립하는 초기 작업에 감사드립니다. 우리는 원고를 읽고 편집 한 Kelly Tellez와 Graham Buchan에게 감사드립니다. 브릴리언트 옐로우 염료 (Sigma)의 사용을 제안함에있어 Andrew Seeds와 Julie Simpson에게 선구자적인 노력과 조언 및 지원에 감사드립니다. 이 연구는 Mary E. Groff 외과 및 의학 연구 및 교육 자선 신탁, Bronfman 과학 센터 및 Hellman 휄로우 프로그램에 의해 부분적으로 지원됩니다.
Materials
| High-Flex Tygon PVC Clear Tubing | McMaster-Carr | 5229K54 | ID 1/8", OD 1/4", used with micropipettor tips and mesh to construct mouth aspirators |
| Micropipette tips (1ml and 200ul) | Genesee Scientific | 24-165, 24-150R | |
| Nylon Mesh Screen, 2" x 2.6" | McMaster-Carr | 9318T44 | Used to construct grooming chamber and mouth aspirators |
| Dumont #5 Forceps | Roboz Surgical Instrument | RS-5050 | |
| Brilliant Yellow Dye | Sigma-Aldrich | 201375-25G | we recommend use of nitrile gloves while handling this product |
| Vortexer | Fisher Scientific | 12-812 | set to "touch" |
| Ethanol | Carolina Biological Supply | 86-1282 | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | VWR International | 10025-726 | |
| 0.65 ml microcentrifuge tubes | VWR International | 20170-293 | tubes can be reused with successive assays |
| UV 96 well plate | Corning | 26014017 | |
| BioTek Synergy HTX Platereader | BioTek | need to download catalog to access product number | http://www.biotek.com/products/microplate_detection/synergy_htx_multimode_microplate_reader.html?tab=overview |
| Gen5 Microplate Reader and Imager Software | BioTek | ||
| Microsoft Excel | Microsoft | https://www.microsoftstore.com/store/msusa/en_US/pdp/Excel-2016/productID.323021400?tduid=(65d098c0e83b86c952bdff5b0719c83f)(256380)(2459594)(SRi0yYDlqd0-LI..ql4M2LoZBEhcBljvIA)() | |
| Drosophila Incubator | Tritech | DT2-CIRC-TK | |
| 1/4" acrylic plastic | McMaster-Carr | 8473K341 | |
| 8-32 nuts | McMaster-Carr | 90257A009 | |
| 8-32 x 1" hex cap screws | McMaster-Carr | 92185A199 | the bottom plate needs to be tapped for this size screw |
| 8-32 x 1/2" hex cap screws | McMaster-Carr | 92185A194 | the second plate from the top needs to be tapped |
| 2-56 3/8" flat head phillips machine screws | McMaster-Carr | 91500A088 | these hold the two middle plates together |
| 0.175" ID, 1/4" OD, 0.34" aluminum pipe | McMaster-Carr | 92510A044 | Manufactured in-house; product listed is approximately the same dimensions and should work for size 8 screws. These act as sheaths for the 1" screws and set the hex cap up slightly from the surface of the top plate |
References
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