Kvantifisering av Drosophila Grooming Behavior
Summary
Denne protokollen beskriver en skalerbar individuell grooming assay teknikk i Drosophila som gir robust, kvantitativ data for å måle grooming oppførsel. Metoden er basert på å sammenligne forskjellen i opphopning av fargestoffer på kroppene til ukjente dyr i forhold til preparerte dyr over en bestemt tidsperiode.
Abstract
Drosophila grooming behavior er et komplekst multi-trinns lokomotorisk program som krever koordinert bevegelse av både forben og bakben. Her presenterer vi en grooming assay protokoll og ny kammer design som er kostnadseffektiv og skalerbar for enten små eller store studier av Drosophila grooming. Fluer er støvet over hele kroppen med Brilliant Yellow farge og gitt tid til å fjerne fargestoffet fra kroppene sine i kammeret. Fluer blir deretter avsatt i et sett volum etanol for å oppløse fargestoffet. Den relative spektralabsorbansen av fargestoff-etanolprøver for preparerte versus ungromede dyr måles og registreres. Protokollen gir kvantitative data om fargestoffsakkumulering for individuelle fluer, som lett kan beregnes og sammenlignes på tvers av prøver. Dette tillater eksperimentelle design å enkelt vurdere grooming evne for mutant dyre studier eller krets manipulasjoner. Denne effektive prosedyren er både allsidig og skalerbar. Vi viser wOrk-flow av protokollen og sammenlignende data mellom WT dyr og mutant dyr for Drosophila type I Dopamine Receptor ( DopR ).
Introduction
Grooming i Drosophila melanogaster ( D. melanogaster ) er en robust medfødt atferd som involverer koordinering av flere uavhengige motorprogrammer 1 . Fruktfluer renser deres støv, mikrober og andre patogener som kan hemme normal fysiologisk funksjon som syn og fly, eller føre til betydelige immunforsvar. Ved å føle og reagere på både mekanisk 2 og immun aktivering 3 , flyr fluene gjentatt på bena sammen eller på en målrettet kroppsregion til den er tilstrekkelig ren og grooming utvikler seg til en annen del av kroppen. Fluer utfører bevegelsesbevegelser i forskjellige begivenheter som stort sett forekommer i stereotype mønstre 1 , 4 . Et oppførselshierarki blir tydelig som groomsignaler prioriteres. Kretskort og aktivitetsmønster er identifisert i støtte oFa modell som grooming programmer øverst i hierarkiet oppstår først og undertrykker parallelle signaler fra områder av kroppen som blir preparert senere 5 . Høyeste prioritet er gitt til hodet, deretter magen, vingene og til slutt thoraxen 5 .
Lekeprogrammet i D. melanogaster er et ideelt system for å studere nevrale kretser, modulerende molekylære signaler og nevrotransmittere. For eksempel, kompromittering av nevrofibrominfunksjon 6 , tap av Drosophila fragile X mentalt retardasjonsprotein ( dfmr1 ) 7 og eksponering for bisfenol A (BPA) 8 forårsaker altfor groom og annen oppførsel som er analog med diskrete menneskelige symptomer på nevrofibromatose, skjøre X Syndrom og aspekter av autismespektrumforstyrrelser og henholdsvis ADHD (Attention-Deficit Hyperactivity Disorder). Grooming atferd kan også være habituaTed differensielt over mutantstammer 2 , utlån denne motorprogrammet til studier av atferdsmessig plastisitet. Bredden av nevrologiske fenomener som kan modelleres av Drosophila krever en ny komparativ tilnærming for å måle flygens evne til å pleie seg selv.
Den kombinerte virkningen av vesikulære monoamintransportører og den relative overflaten av dopamin og andre biogene aminer i kroppen har vist seg å formidle fruktluftspleieadferd 9 , 10 . Octopamin og dopamin stimulerer sammenlignbar hindleg grooming aktivitet i decapitated fluer, mens tyramin, forløperen av oktopamin, også utløser grooming i mindre grad 7 . Fire dopaminreseptorer er identifisert i D. melanogaster 11 , 12 , 13 , 14 </sup>. Ved å bruke groomanalysemetoden beskrevet i denne protokollen, bestemte vi en rolle for type I-familien Dopamin Receptor DopR ( DopR, dDA1, dum ) i hindleg grooming behavior 15 .
Grooming kan indirekte kvantifiseres ved å se på omfanget av renslighet som et dyr kan fullstendig grooms etter dusting hele kroppen med et markørfarger eller fluorescerende støv 5 , 16 . Resten av støv igjen på kroppen kan brukes som en relativ markør for den generelle oppførelsen. Dusty flyr etter å ha fått tilstrekkelig tid til å gifte seg, kan vise seg et bestemt underskudd i grooming behavior. Som grooming undersøkelser har blitt mer omfattende, har protokoller innarbeidet slik praksis som halshugning for å legge farmakologiske behandlinger på nakkebindende nerver 10 , taktil stimulering av børster for å fremkalle grooming respons 2 ,Og videoopptak av oppførsel 15 . Direkte observasjon av grooming kan enkelt studeres ved hjelp av visuell observasjon og manuell opptak av frekvens og varighet av bestemte grooming hendelser 4 .
Vi har designet et femten brønnkammer som kan bygges med en 3D-skriver eller laserkutter, og tegningene er tilgjengelige for reproduksjon 15 . Designet bruker to sammenføyde sentralplater med åpninger som er tilpasset og adskilt av mesh og to ytterligere glidende topp- og bunnplater, hvorfra fluer og / eller fargestoffer er lastet. Etter at støvfluene har tid til å pleie, legger vi dem i etanol for å oppløseliggjøre fargestoffet og måle absorbansen av denne løsningen ved bølgelengden av fargestoffet. En plate leser kan brukes til flere parallelle prøver eller et enkeltlest spektrofotometer kan brukes til individuelle prøver. Denne metoden minimerer feilen fremkalt ved håndtering og alLows for grooming analyser skal kjøres på en mindre, kostnadseffektiv skala. Denne metoden er avledet og modifisert fra metodene pioneret av Julie Simpson og Andrew Seeds, som bruker større pleiekamre med varmeelementer for temperaturfølsomme kretsmanipulasjoner 5 . Følgende protokoll viser kvantifiseringen av grooming av hele kroppen, samt viser alternative metoder for kvantifisering av fargestoffer på individuelle kroppsdeler. Vi presenterer også prøve-sammenligningsdata mellom WT- og DopR- mutanter, samt metoder for beregning av en enkel ytelsesindeks for pleieadferd.
Protocol
Representative Results
Discussion
Grooming-analysen er relativt enkel, men vi vil forsiktighetseksperimenter være spesielt oppmerksomme på følgende problemer. Opprettholde en tett forsegling ved å stramme skruene på topp- og bunnplaten etter å ha innført fluer og fargestoff er viktig for reproducerbare resultater. Brilliant Yellow-fargestoffet er veldig fint, og løse ledd vil tillate tap av fargestoffer fra kammerets kanter. Uregelmessigheten i fargestoffinnholdet for hver brønn kan lett kaste av groomkvantifisering, da ikke-jevn støving vil ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi ønsker å takke Brian Shepherd, Tat Udomritthiruj, Aaron Willey, Ruby Froom, Elise Pitmon og Rose Hedreen for tidlig arbeid i testing og etablering av denne metodikken og kammerdesign. Vi takker Kelly Tellez og Graham Buchan for å lese og redigere manuskriptet. Vi takker Andrew Seeds og Julie Simpson for deres banebrytende arbeid og deres råd og støtte i å foreslå bruken av Brilliant Yellow Dye (Sigma). Dette arbeidet støttes delvis av Mary E. Groff Kirurgisk og medisinsk forskning og utdanning Charitable Trust, Bronfman Science Center, og Hellman Fellows Program.
Materials
| High-Flex Tygon PVC Clear Tubing | McMaster-Carr | 5229K54 | ID 1/8", OD 1/4", used with micropipettor tips and mesh to construct mouth aspirators |
| Micropipette tips (1ml and 200ul) | Genesee Scientific | 24-165, 24-150R | |
| Nylon Mesh Screen, 2" x 2.6" | McMaster-Carr | 9318T44 | Used to construct grooming chamber and mouth aspirators |
| Dumont #5 Forceps | Roboz Surgical Instrument | RS-5050 | |
| Brilliant Yellow Dye | Sigma-Aldrich | 201375-25G | we recommend use of nitrile gloves while handling this product |
| Vortexer | Fisher Scientific | 12-812 | set to "touch" |
| Ethanol | Carolina Biological Supply | 86-1282 | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | VWR International | 10025-726 | |
| 0.65 ml microcentrifuge tubes | VWR International | 20170-293 | tubes can be reused with successive assays |
| UV 96 well plate | Corning | 26014017 | |
| BioTek Synergy HTX Platereader | BioTek | need to download catalog to access product number | http://www.biotek.com/products/microplate_detection/synergy_htx_multimode_microplate_reader.html?tab=overview |
| Gen5 Microplate Reader and Imager Software | BioTek | ||
| Microsoft Excel | Microsoft | https://www.microsoftstore.com/store/msusa/en_US/pdp/Excel-2016/productID.323021400?tduid=(65d098c0e83b86c952bdff5b0719c83f)(256380)(2459594)(SRi0yYDlqd0-LI..ql4M2LoZBEhcBljvIA)() | |
| Drosophila Incubator | Tritech | DT2-CIRC-TK | |
| 1/4" acrylic plastic | McMaster-Carr | 8473K341 | |
| 8-32 nuts | McMaster-Carr | 90257A009 | |
| 8-32 x 1" hex cap screws | McMaster-Carr | 92185A199 | the bottom plate needs to be tapped for this size screw |
| 8-32 x 1/2" hex cap screws | McMaster-Carr | 92185A194 | the second plate from the top needs to be tapped |
| 2-56 3/8" flat head phillips machine screws | McMaster-Carr | 91500A088 | these hold the two middle plates together |
| 0.175" ID, 1/4" OD, 0.34" aluminum pipe | McMaster-Carr | 92510A044 | Manufactured in-house; product listed is approximately the same dimensions and should work for size 8 screws. These act as sheaths for the 1" screws and set the hex cap up slightly from the surface of the top plate |
References
- Szebenyi, A. L. Cleaning Behaviour in Drosophila-Melanogaster. Animal. Behaviour. 17, (1969).
- Corfas, G., Dudai, Y. Habituation and dishabituation of a cleaning reflex in normal and mutant Drosophila. J Neurosci. 9 (1), 56-62 (1989).
- Yanagawa, A., Guigue, A. M. A., Marion-Poll, F. Hygienic grooming is induced by contact chemicals in Drosophila melanogaster. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 8, (2014).
- Dawkins, R., Dawkins, M. Hierarchical Organization and Postural Facilitation – Rules for Grooming in Flies. Animal Behaviour. 24 (Nov), 739-755 (1976).
- Seeds, A. M., et al. A suppression hierarchy among competing motor programs drives sequential grooming in Drosophila. Elife. 3, e02951 (2014).
- King, L. B., et al. Neurofibromin Loss of Function Drives Excessive Grooming in Drosophila. G3-Genes Genomes Genetics. 6 (4), 1083-1093 (2016).
- Tauber, J. M., Vanlandingham, P. A., Zhang, B. Elevated Levels of the Vesicular Monoamine Transporter and a Novel Repetitive Behavior in the Drosophila Model of Fragile X Syndrome. Plos One. 6 (11), e27100 (2011).
- Kaur, K., Simon, A. F., Chauhan, V., Chauhan, A. Effect of bisphenol A on Drosophila melanogaster behavior–a new model for the studies on neurodevelopmental disorders. Behav Brain Res. 284, 77-84 (2015).
- Chang, H. Y., et al. Overexpression of the Drosophila vesicular monoamine transporter increases motor activity and courtship but decreases the behavioral response to cocaine. Molecular Psychiatry. 11 (1), 99-113 (2006).
- Yellman, C., Tao, H., He, B., Hirsh, J. Conserved and sexually dimorphic behavioral responses to biogenic amines in decapitated Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (8), 4131-4136 (1997).
- Feng, G. P., et al. Cloning and functional characterization of a novel dopamine receptor from Drosophila melanogaster. Journal of Neuroscience. 16 (12), 3925-3933 (1996).
- Gotzes, F., Balfanz, S., Baumann, A. Primary Structure and Functional-Characterization of a Drosophila Dopamine-Receptor with High Homology to Human D(1/5). Receptors. Receptors & Channels. 2 (2), 131-141 (1994).
- Han, K. A., Millar, N. S., Grotewiel, M. S., Davis, R. L. DAMB, a novel dopamine receptor expressed specifically in Drosophila mushroom bodies. Neuron. 16 (6), 1127-1135 (1996).
- Sugamori, K. S., Demchyshyn, L. L., Mcconkey, F., Forte, M. A., Niznik, H. B. A Primordial Dopamine D1-Like Adenylyl Cyclase-Linked Receptor from Drosophila-Melanogaster Displaying Poor Affinity for Benzazepines. Febs Letters. 362 (2), 131-138 (1995).
- Pitmon, E., et al. The D1 family dopamine receptor, DopR, potentiates hind leg grooming behavior in Drosophila. Genes Brain and Behavior. 15 (3), 327-334 (2016).
- Phillis, R. W., et al. Isolation of mutations affecting neural circuitry required for grooming behavior in Drosophila melanogaster. Génétique. 133 (3), 581-592 (1993).
- Hampel, S., Franconville, R., Simpson, J. H., Seeds, A. M. A neural command circuit for grooming movement control. Elife. 4, e08758 (2015).
- Kays, I., Cvetkovska, V., Chen, B. E. Structural and functional analysis of single neurons to correlate synaptic connectivity with grooming behavior. Nature Protocols. 9 (1), 1-10 (2014).
