Количественное определение поведения дрозофилы
Summary
В этом протоколе описывается масштабируемая индивидуальная методика анализа grooming у Drosophila, которая дает надежные количественные данные для измерения поведения ухода. Метод основан на сравнении различий в накоплении красителя на телах ухоженных и ухоженных животных за определенный период времени.
Abstract
Drosophila – это сложная многоступенчатая локомоторная программа, которая требует скоординированного движения как передних, так и задних конечностей. Здесь мы представляем протокол анализа grooming и новую конструкцию камеры, которая экономична и масштабируема для небольших или крупномасштабных исследований по уходу за Drosophila . Мухи пылиются по всему телу с помощью блестящей желтой краски и дают время для удаления красителя из их тел внутри камеры. Мухи затем осаждаются в заданном объеме этанола для солюбилизации красителя. Измеряют и регистрируют относительную спектральную абсорбцию образцов красителя-этанола для ухоженных и неопытных животных. Протокол дает количественные данные о накоплении красителя для отдельных мух, которые можно легко усреднить и сравнить по выборкам. Это позволяет экспериментальным проектам легко оценивать способность ухаживать за мутантными исследованиями на животных или с помощью схемных манипуляций. Эта эффективная процедура универсальна и масштабируема. Покажем wOrk-поток протокола и сравнительные данные между животными WT и мутантными животными для Dopamine рецептора Drosophila I типа ( DopR ).
Introduction
Уход в Drosophila melanogaster ( D. melanogaster ) – это надежное врожденное поведение, которое включает в себя координацию нескольких независимых моторных программ 1 . Фруктовые мухи очищают свои тела от пыли, микробов и других патогенов, которые могут препятствовать нормальной физиологической функции, такой как зрение и полет, или приводят к значительным иммунным проблемам. При восприятии и реагировании как на механическую 2, так и на иммунную активацию 3 , мухи повторно натирают свои ноги вместе или на целевую область тела, пока они не станут достаточно чистыми, а ходьба прогрессирует в другую часть тела. Мухи совершают движения в отдельных поединках, которые в основном происходят в стереотипных узорах 1 , 4 . Поведенческая иерархия становится очевидной, так как приоритетные сигналы имеют приоритет. Схемы и схемы деятельности были определены в поддержку oFA модель , которая холить программы на вершине иерархии происходят первую и подавлять параллельные сигналы от участков тела, которые впоследствии ухоженных 5. Наивысший приоритет отдается голове, затем животу, крыльям и, наконец, грудной клетке 5 .
Программа ухода в D. melanogaster – идеальная система для изучения нейронных цепей, модулирующих молекулярных сигналов и нейротрансмиттеров. Например, компромисс функции нейрофибромина 6 , потеря хрупкого Х- запаса умственной отсталости Drosophila ( dfmr1 ) 7 и воздействие бисфенола A (BPA) 8 все вызывают чрезмерный уход и другие поведения, которые аналогичны дискретным человеческим симптомам нейрофиброматоза, хрупким X Синдром и аспекты расстройств спектра аутизма и синдрома дефицита внимания с гиперактивностью (ADHD), соответственно. Сходное поведение также может быть habituaВ зависимости от мутантных штаммов 2 , предоставляя эту моторную программу исследованиям поведенческой пластичности. Широта неврологических явлений, которые могут быть смоделированы Drosophila, требует нового сравнительного подхода, чтобы измерить способность мух жениться на себе.
Было показано, что совместное действие везикулярных транспортеров моноаминов и относительное обилие дофамина и других биогенных аминов в организме являются опосредующими поведением плодовых мух 9 , 10 . Октапамин и дофамин стимулируют сравнимую активность задней конечности у обезглавленных мух, в то время как тирамин, предшественник октопамина, также вызывает уход в меньшей степени 7 . Четыре рецептора допамина были идентифицированы в D. melanogaster 11 , 12 , 13 , 14 </sup>. Используя метод анализа grooming, описанный в этом протоколе, мы определили роль для рецептора Dopamine DopR семейства I типа ( DopR, dDA1, dumb ) в поведении 15 .
Уход можно косвенно определить количественно, посмотрев на степень чистоты, с помощью которой животное может полностью ухаживать после вытирания всего тела маркерным красителем или флуоресцентной пылью 5 , 16 . Остальная часть пыли, оставленной на теле, может использоваться как относительный маркер для общего поведения. Пыльные мухи после того, как им предоставлено достаточное время для жениха, может проявиться определенный дефицит в поведении. Поскольку исследования по уходу за больными стали более обширными, протоколы включили такие методы, как обезглавливание, чтобы добавить фармакологическое лечение на соединительные нервы 10 шеи, тактильную стимуляцию щетинок, чтобы вызвать реакцию 2 ухода,И видеозапись поведения 15 . Прямое наблюдение за ходьбой можно легко изучить, используя визуальное наблюдение и вручную регистрируя частоту и продолжительность конкретных событий 4 .
Мы разработали 15-луночную камеру для уборки, которая может быть построена с помощью 3D-принтера или лазерной резки, а чертежные чертежи доступны для воспроизведения 15 . В конструкции используются две соединенные центральные пластины с отверстиями, соответствующими друг другу и разделенные сеткой, а также две дополнительные скользящие верхние и нижние пластины, из которых загружаются мухи и / или краситель. После того, как высушенные мухи успели дойти до жениха, мы их осаждаем в этаноле, чтобы солюбилизировать краситель и измерять поглощение этого раствора на длине волны красителя. Считыватель пластин может использоваться для нескольких параллельных образцов, или для отдельных образцов может использоваться одночиповой спектрофотометр. Этот метод минимизирует ошибку, вызванную обработкой, иМинимумы для анализа холинга, которые будут выполняться на меньшем, экономичном уровне. Этот метод получен и модифицирован по методам, впервые предложенным Джули Симпсон и Эндрю Сейдс, которые используют более крупные камеры для обжига с нагревательными элементами для температурно-чувствительных схемных манипуляций 5 . Следующий протокол демонстрирует количественную оценку ухода за всем телом, а также показывает альтернативные методы количественного накопления красителя на отдельных частях тела. Мы также представляем данные сравнения образцов между мутантами WT и DopR , а также методы расчета простого индекса производительности для поведения ухода.
Protocol
Representative Results
Discussion
Анализ холинга относительно прост, но мы будем предупреждать экспериментаторов, чтобы обратить особое внимание на следующие проблемы. Поддержание плотного уплотнения затягиванием винтов на верхней и нижней пластинах после введения мух и красителей имеет важное значение для воспрои?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотим поблагодарить Брайана Шепарда, Тата Удомриттируджа, Аарона Вилли, Руби Фрума, Элиз Питмон и Роуз Хедрин за раннюю работу по тестированию и установлению этой методологии и камерных проектов. Мы благодарим Келли Теллеса и Грэма Бьюкена за чтение и редактирование рукописи. Мы благодарим Эндрю Семса и Джули Симпсон за их новаторскую работу и их советы и поддержку, предлагая использовать Brilliant Yellow Dye (Sigma). Эта работа частично поддерживается благотворительным фондом хирургических и медицинских исследований и образования Мэри Э. Грофф, Научным центром Бронфмана и Программой стипендиатов Хелмана.
Materials
| High-Flex Tygon PVC Clear Tubing | McMaster-Carr | 5229K54 | ID 1/8", OD 1/4", used with micropipettor tips and mesh to construct mouth aspirators |
| Micropipette tips (1ml and 200ul) | Genesee Scientific | 24-165, 24-150R | |
| Nylon Mesh Screen, 2" x 2.6" | McMaster-Carr | 9318T44 | Used to construct grooming chamber and mouth aspirators |
| Dumont #5 Forceps | Roboz Surgical Instrument | RS-5050 | |
| Brilliant Yellow Dye | Sigma-Aldrich | 201375-25G | we recommend use of nitrile gloves while handling this product |
| Vortexer | Fisher Scientific | 12-812 | set to "touch" |
| Ethanol | Carolina Biological Supply | 86-1282 | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | VWR International | 10025-726 | |
| 0.65 ml microcentrifuge tubes | VWR International | 20170-293 | tubes can be reused with successive assays |
| UV 96 well plate | Corning | 26014017 | |
| BioTek Synergy HTX Platereader | BioTek | need to download catalog to access product number | http://www.biotek.com/products/microplate_detection/synergy_htx_multimode_microplate_reader.html?tab=overview |
| Gen5 Microplate Reader and Imager Software | BioTek | ||
| Microsoft Excel | Microsoft | https://www.microsoftstore.com/store/msusa/en_US/pdp/Excel-2016/productID.323021400?tduid=(65d098c0e83b86c952bdff5b0719c83f)(256380)(2459594)(SRi0yYDlqd0-LI..ql4M2LoZBEhcBljvIA)() | |
| Drosophila Incubator | Tritech | DT2-CIRC-TK | |
| 1/4" acrylic plastic | McMaster-Carr | 8473K341 | |
| 8-32 nuts | McMaster-Carr | 90257A009 | |
| 8-32 x 1" hex cap screws | McMaster-Carr | 92185A199 | the bottom plate needs to be tapped for this size screw |
| 8-32 x 1/2" hex cap screws | McMaster-Carr | 92185A194 | the second plate from the top needs to be tapped |
| 2-56 3/8" flat head phillips machine screws | McMaster-Carr | 91500A088 | these hold the two middle plates together |
| 0.175" ID, 1/4" OD, 0.34" aluminum pipe | McMaster-Carr | 92510A044 | Manufactured in-house; product listed is approximately the same dimensions and should work for size 8 screws. These act as sheaths for the 1" screws and set the hex cap up slightly from the surface of the top plate |
References
- Szebenyi, A. L. Cleaning Behaviour in Drosophila-Melanogaster. Animal. Behaviour. 17, (1969).
- Corfas, G., Dudai, Y. Habituation and dishabituation of a cleaning reflex in normal and mutant Drosophila. J Neurosci. 9 (1), 56-62 (1989).
- Yanagawa, A., Guigue, A. M. A., Marion-Poll, F. Hygienic grooming is induced by contact chemicals in Drosophila melanogaster. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 8, (2014).
- Dawkins, R., Dawkins, M. Hierarchical Organization and Postural Facilitation – Rules for Grooming in Flies. Animal Behaviour. 24 (Nov), 739-755 (1976).
- Seeds, A. M., et al. A suppression hierarchy among competing motor programs drives sequential grooming in Drosophila. Elife. 3, e02951 (2014).
- King, L. B., et al. Neurofibromin Loss of Function Drives Excessive Grooming in Drosophila. G3-Genes Genomes Genetics. 6 (4), 1083-1093 (2016).
- Tauber, J. M., Vanlandingham, P. A., Zhang, B. Elevated Levels of the Vesicular Monoamine Transporter and a Novel Repetitive Behavior in the Drosophila Model of Fragile X Syndrome. Plos One. 6 (11), e27100 (2011).
- Kaur, K., Simon, A. F., Chauhan, V., Chauhan, A. Effect of bisphenol A on Drosophila melanogaster behavior–a new model for the studies on neurodevelopmental disorders. Behav Brain Res. 284, 77-84 (2015).
- Chang, H. Y., et al. Overexpression of the Drosophila vesicular monoamine transporter increases motor activity and courtship but decreases the behavioral response to cocaine. Molecular Psychiatry. 11 (1), 99-113 (2006).
- Yellman, C., Tao, H., He, B., Hirsh, J. Conserved and sexually dimorphic behavioral responses to biogenic amines in decapitated Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (8), 4131-4136 (1997).
- Feng, G. P., et al. Cloning and functional characterization of a novel dopamine receptor from Drosophila melanogaster. Journal of Neuroscience. 16 (12), 3925-3933 (1996).
- Gotzes, F., Balfanz, S., Baumann, A. Primary Structure and Functional-Characterization of a Drosophila Dopamine-Receptor with High Homology to Human D(1/5). Receptors. Receptors & Channels. 2 (2), 131-141 (1994).
- Han, K. A., Millar, N. S., Grotewiel, M. S., Davis, R. L. DAMB, a novel dopamine receptor expressed specifically in Drosophila mushroom bodies. Neuron. 16 (6), 1127-1135 (1996).
- Sugamori, K. S., Demchyshyn, L. L., Mcconkey, F., Forte, M. A., Niznik, H. B. A Primordial Dopamine D1-Like Adenylyl Cyclase-Linked Receptor from Drosophila-Melanogaster Displaying Poor Affinity for Benzazepines. Febs Letters. 362 (2), 131-138 (1995).
- Pitmon, E., et al. The D1 family dopamine receptor, DopR, potentiates hind leg grooming behavior in Drosophila. Genes Brain and Behavior. 15 (3), 327-334 (2016).
- Phillis, R. W., et al. Isolation of mutations affecting neural circuitry required for grooming behavior in Drosophila melanogaster. Génétique. 133 (3), 581-592 (1993).
- Hampel, S., Franconville, R., Simpson, J. H., Seeds, A. M. A neural command circuit for grooming movement control. Elife. 4, e08758 (2015).
- Kays, I., Cvetkovska, V., Chen, B. E. Structural and functional analysis of single neurons to correlate synaptic connectivity with grooming behavior. Nature Protocols. 9 (1), 1-10 (2014).
