मानव इन्फ्लूएंजा ए वायरस के संक्रमण का Zebrafish मॉडल का प्रयोग करना एंटीवायरल ड्रग्स स्क्रीन और विशेषताएँ मेजबान प्रतिरक्षा सेल प्रतिक्रिया के लिए
Summary
Systemic and localized zebrafish infection models for human influenza A virus are demonstrated. Using a systemic infection model, zebrafish can be used to screen antiviral drugs. Using a localized infection model, zebrafish can be used to characterize host immune cell responses.
Abstract
Each year, seasonal influenza outbreaks profoundly affect societies worldwide. In spite of global efforts, influenza remains an intractable healthcare burden. The principle strategy to curtail infections is yearly vaccination. In individuals who have contracted influenza, antiviral drugs can mitigate symptoms. There is a clear and unmet need to develop alternative strategies to combat influenza. Several animal models have been created to model host-influenza interactions. Here, protocols for generating zebrafish models for systemic and localized human influenza A virus (IAV) infection are described. Using a systemic IAV infection model, small molecules with potential antiviral activity can be screened. As a proof-of-principle, a protocol that demonstrates the efficacy of the antiviral drug Zanamivir in IAV-infected zebrafish is described. It shows how disease phenotypes can be quantified to score the relative efficacy of potential antivirals in IAV-infected zebrafish. In recent years, there has been increased appreciation for the critical role neutrophils play in the human host response to influenza infection. The zebrafish has proven to be an indispensable model for the study of neutrophil biology, with direct impacts on human medicine. A protocol to generate a localized IAV infection in the Tg(mpx:mCherry) zebrafish line to study neutrophil biology in the context of a localized viral infection is described. Neutrophil recruitment to localized infection sites provides an additional quantifiable phenotype for assessing experimental manipulations that may have therapeutic applications. Both zebrafish protocols described faithfully recapitulate aspects of human IAV infection. The zebrafish model possesses numerous inherent advantages, including high fecundity, optical clarity, amenability to drug screening, and availability of transgenic lines, including those in which immune cells such as neutrophils are labeled with fluorescent proteins. The protocols detailed here exploit these advantages and have the potential to reveal critical insights into host-IAV interactions that may ultimately translate into the clinic.
Introduction
विश्व स्वास्थ्य संगठन (डब्ल्यूएचओ) के मुताबिक, इन्फ्लूएंजा वायरस वयस्कों के 5-10% और सालाना बच्चों के 20-30% संक्रमित और गंभीर बीमारी के 3-5 लाख मामलों का कारण है और दुनिया भर में 1 अप करने के लिए 500,000 से मौत हुई है। इन्फ्लूएंजा के खिलाफ वार्षिक टीकाकरण बीमारी को रोकने के लिए सबसे अच्छा विकल्प रहते हैं। डब्ल्यूएचओ वैश्विक कार्य योजना जैसे प्रयासों का आदेश रुग्णता और मौसमी फ्लू के प्रकोप 2 के साथ जुड़े मृत्यु दर को कम करने के लिए और अधिक शक्तिशाली वैक्सीन रणनीतियों में मौसमी टीका उपयोग, टीका उत्पादन क्षमता, और अनुसंधान और विकास में वृद्धि हुई है। Neuraminidase अवरोधकों (जैसे Zanamivir और oseltamivir) की तरह एंटीवायरल दवाओं के कुछ देशों में उपलब्ध हैं और जब शुरुआत 3, 4, 5 के पहले 48 घंटे के भीतर प्रशासित, कम करने के लक्षणों में कारगर साबित किया है। वैश्विक प्रयासों के बावजूद, मौसमी इन्फ्लूएंजा की रोकथाम कहांtbreaks इस समय एक बड़ी चुनौती के रूप में इन्फ्लूएंजा वायरस प्रतिजनी बहाव अक्सर वायरस 6 के बदलते जीनोम के लिए अनुकूल करने के लिए मौजूदा क्षमताओं से अधिक बनी हुई है। वायरस के नए उपभेदों को निशाना वैक्सीन रणनीतियों अग्रिम में विकसित किया जाना चाहिए और कभी कभी उपभेदों के प्रकार है कि अंततः एक इन्फ्लूएंजा के मौसम में प्रबल में अप्रत्याशित परिवर्तन की वजह से बेहतर की तुलना में कम प्रभावी गाया जाता है। इन कारणों के लिए, एक स्पष्ट के संक्रमण से युक्त और मौत को कम करने के लिए वैकल्पिक चिकित्सकीय रणनीति विकसित करने की जरूरत है। मेजबान वायरस बातचीत का एक बेहतर समझ हासिल करने के द्वारा, यह नया विरोधी इन्फ्लूएंजा दवाओं और सहायक उपचारों 7, 8 का विकास संभव हो सकता है।
मानव मेजबान इन्फ्लूएंजा ए वायरस (IAV) बातचीत जटिल है। मानव IAV संक्रमण के कई पशु मॉडल आदेश, समेत मेजबान वायरस बातचीत में जानकारी हासिल करने के लिए विकसित किया गया हैचूहों, गिनी सूअरों, कपास चूहे, हैम्स्टर, ferrets, और मकाक 9 हैैं। महत्वपूर्ण डेटा है कि मेजबान IAV गतिशीलता की समझ में वृद्धि की है प्रदान करने, प्रत्येक मॉडल जीव महत्वपूर्ण कमियां है कि जब मानव चिकित्सा में निष्कर्षों का अनुवाद करने का प्रयास विचार किया जाना चाहिए के पास। उदाहरण के लिए, चूहों, जो सबसे अधिक व्यापक रूप से इस्तेमाल मॉडल हैं, आसानी से IAV प्रेरित संक्रमण के लक्षण जब मानव इन्फ्लूएंजा आइसोलेट्स 9 से संक्रमित विकसित नहीं है। इसका कारण यह है चूहों की कमी मानव इन्फ्लूएंजा के लिए प्राकृतिक tropism आइसोलेट्स के बाद से माउस उपकला कोशिकाओं मानव उपकला कोशिकाओं 10 पर व्यक्त α-2,6 सियालिक एसिड संबंधों के बजाय α-2,3 सियालिक एसिड संबंधों को अभिव्यक्त करता है। Hemagglutinin मानव IAV में मौजूद प्रोटीन कृपापूर्वक बाँध और असर रिसेप्टर की मध्यस्थता endocytosis 9, 11 के माध्यम से α-2,6 सियालिक एसिड लिंकेज मेजबान कोशिकाओं में प्रवेश आइसोलेट्स, </sअप> 12, 13। एक परिणाम के रूप में, यह अब स्वीकार कर लिया है मानव इन्फ्लूएंजा के लिए माउस मॉडल विकसित करने में, देखभाल आदेश रोग phenotypes कि मानव बीमारी के पहलुओं पुनरावृत्ति को प्राप्त करने में इन्फ्लूएंजा की उचित तनाव के साथ माउस का उचित तनाव जोड़ी के लिए रखा जाना चाहिए कि। इसके विपरीत, ferrets के ऊपरी श्वसन तंत्र में उपकला कोशिकाओं α-2,6 सियालिक एसिड लिंकेज कि मानव कोशिकाओं 14 के समान होती है। Pathogenicity और मानव और एवियन इन्फ्लूएंजा वायरस 14 की योग्यता, 15 सहित मानव रोग में मनाया रोग और नैदानिक विशेषताओं के कई संक्रमित ferrets का हिस्सा है। उन्होंने यह भी अत्यधिक टीका प्रभावकारिता परीक्षणों के लिए उत्तरदायी हैं। फिर भी, मानव इन्फ्लूएंजा के लिए भाल मॉडल है कि सांख्यिकीय महत्वपूर्ण का अधिग्रहण कर मुख्यतः उनके आकार और पशुपालन की लागत से संबंधित कई नुकसान हैखिचड़ी भाषा चुनौतीपूर्ण डेटा। इसके अलावा, ferrets पहले दवा फार्माकोकाइनेटिक्स, जैव उपलब्धता, और विषाक्तता कि परीक्षण प्रभावकारिता मुश्किल बनाने में मतभेद प्रदर्शित किया है। उदाहरण के लिए, ferrets M2 आयन चैनल अवरोध amantadine से 16 विषाक्तता दिखा रहे हैं। इस प्रकार, यह स्पष्ट है कि मानव IAV संक्रमण के बारे में सवालों का अध्ययन करने के लिए एक पशु मॉडल को चुनने के लिए, यह महत्वपूर्ण है अपने निहित फायदे और सीमाएं, और मेजबान वायरस बातचीत है कि जांच के तहत के पहलू पर विचार करें।
Zebrafish, Danio rerio, एक पशु मॉडल है कि सूक्ष्म जीवाणु संक्रमण की जांच के लिए अद्वितीय अवसर प्रदान करता है, प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की मेजबानी, और संभावित दवा के उपचारों 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, है <समर्थन वर्ग = "xref"> 24, 25, 26, 27, 28। Zebrafish में कोशिकाओं की सतह पर α-2,6-लिंक्ड सियालिक एसिड की उपस्थिति IAV, जो संक्रमण के अध्ययन में वहन किया गया था और IAV 19 की एक फ्लोरोसेंट संवाददाता तनाव का उपयोग vivo में imaged करने के लिए अपनी संवेदनशीलता का सुझाव दिया। IAV संक्रमित Zebrafish में, एंटीवायरल ifnphi1 और MXA टेप की वृद्धि की अभिव्यक्ति संकेत दिया है कि एक सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के लिए प्रेरित किया गया था, और विकृति शोफ और ऊतक विनाश सहित IAV संक्रमित zebrafish, द्वारा प्रदर्शित, मानव इन्फ्लूएंजा के संक्रमण में मनाया समान था । इसके अलावा, IAV एंटीवायरल neuraminidase अवरोध Zanamivir सीमित मृत्यु दर और zebrafish 19 में कम वायरल प्रतिकृति।
इस रिपोर्ट में, प्रणाली की शुरुआत करने के लिए एक प्रोटोकॉलzebrafish भ्रूण में आईसी IAV संक्रमणों में वर्णित है। एक सबूत के सिद्धांत के रूप में चिकित्सकीय प्रासंगिक खुराक पर Zanamivir का प्रयोग, एंटीवायरल गतिविधि के लिए स्क्रीनिंग यौगिकों के लिए इस zebrafish IAV संक्रमण मॉडल की उपयोगिता प्रदर्शन किया है। इसके अलावा, zebrafish में एक स्थानीय, उपकला IAV संक्रमण पैदा करने के लिए एक प्रोटोकॉल मूत्राशय तैरना, एक अंग है कि संरचनात्मक और कार्यात्मक स्तनधारी फेफड़ों के 21, 29, 30, 31 के अनुरूप माना जाता है, में वर्णित है। इस स्थानीय IAV संक्रमण मॉडल का उपयोग करना, संक्रमण की साइट के लिए न्युट्रोफिल भर्ती लगाया जा सकता है, IAV संक्रमण और सूजन में न्यूट्रोफिल जीव विज्ञान की भूमिका की जांच के लिए सक्षम करने से। ये zebrafish मॉडल मानव IAV संक्रमण की मौजूदा पशु मॉडल के पूरक हैं और छोटे अणुओं और बढ़ाया रों की संभावना की वजह प्रतिरक्षा सेल प्रतिक्रिया के परीक्षण के लिए विशेष रूप से उपयोगी होते हैंtatistical शक्ति, उच्च throughput assays के लिए moderate- के लिए क्षमता, और क्षमताओं प्रकाश माइक्रोस्कोपी के साथ प्रतिरक्षा सेल व्यवहार और समारोह को ट्रैक करने के लिए।
Protocol
Representative Results
Discussion
लाभ मानव मेजबान रोगज़नक़ बातचीत मॉडल करने के लिए एक छोटा सा जानवर का उपयोग करने से प्राप्त की अधिकतम करने के लिए है, यह अनुसंधान सवालों और परीक्षण परिकल्पना है कि मॉडल प्रणाली के निहित लाभ को भुनाने के ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors wish to thank Mark Nilan for zebrafish care and maintenance and Meghan Breitbach and Deborah Bouchard for propagating NS1-GFP and determining IAV titers. This research was supported by NIGMS grant NIH P20GM103534 and the Maine Agricultural and Forest Experiment Station (Publication Number 3493).
Materials
| Instant Ocean | Spectrum Brands | SS15-10 | |
| 100 x 25 mm sterile disposable Petri dishes | VWR | 89107-632 | |
| Transfer pipettes | Fisherbrand | 13-711-7M | |
| Tricaine- S (MS-222) | Western Chemical | ||
| Borosilicate glass capillary with filament | Sutter Instrument | BF120-69-10 | |
| Flaming/Brown micropipette puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| Zanamivir | AK Scientific | G939 | |
| Dumont #5 forceps | Electron Microscopy Sciences | 72700-D | |
| Microloader tips | Eppendorf | 930001007 | |
| Microscope immersion oil | Olympus | IMMOIL-F30CC | |
| Microscope stage calibration slide | AmScope | MR095 | |
| MPPI-3 pressure injector | Applied Scientific Instrumentation | ||
| Stereo microscope | Olympus | SZ61 | |
| Back pressure unit | Applied Scientific Instrumentation | BPU | |
| Micropipette holder kit | Applied Scientific Instrumentation | MPIP | |
| Foot switch | Applied Scientific Instrumentation | FSW | |
| Micromanipulator | Applied Scientific Instrumentation | MM33 | |
| Magnetic base | Applied Scientific Instrumentation | Magnetic Base | |
| Phenol red | Sigma-Aldrich | P-4758 | |
| Low temperature incubator | VWR | 2020 | |
| SteREO Discovery.V12 | Zeiss | ||
| Illuminator | Zeiss | HXP 200C | |
| Cold light source | Zeiss | CL6000 LED | |
| Glass-bottom multiwell plate, 24 well | Mattek | P24G-0-13-F | |
| Confocal microscope | Olympus | IX-81 with FV-1000 laser scanning confocal system | |
| Fluoview software | Olympus | ||
| Prism v6 | GraphPad | ||
| Influenza A/PR/8/34 (H1N1) virus | Charles River | 490710 | |
| Influenza A X-31, A/Aichi/68 (H3N2) | Charles River | 490715 | |
| Influenza NS1-GFP | Referenced in Manicassamy et al. 2010 | ||
| Tg(mpx:mCherry) | Referenced in Lam et al. 2013 | ||
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