Bottlenose Dolphin (bred snute truncatus) Spermatozoa: innsamling, kryonisk bevaring og Heterologous I Vitro fertilisering
Summary
Her presenterer vi som har blitt brukt for dolphin spermatozoa samling, kryonisk bevaring og heterologous IVF ytelse ved hjelp av bovin oocytes.
Abstract
Bruk cryopreserved dolphin spermatozoa muliggjør utveksling av genetisk materiale mellom vannparker og gjør spermatozoa tilgjengelig for laboratorier for studier for å fremme vår forståelse av marine pattedyr reproduksjon. Heterologous IVF, en erstatning for homologe IVF, kan gi et middel test sperm fruktbarhet potensielle; Kjønnscelle fysiologi og tidlig embryo utvikling; og for å unngå bruk av verdifulle dolphin oocytes, som er vanskelig å få. Her presenterer vi som har blitt brukt til å samle og cryopreserve dolphin spermatozoa. Samlingen av sæd er utført av manuell stimulering på utdannet delfiner. Kryonisk bevaring oppnås med en TRIS eggeplomme basert extender med glyserol. I tillegg presenterer vi en protokoll som beskriver heterologous IVF dolphin spermatozoa og storfe oocytes og som bekrefter hybrid natur resulterende fosteret bruker PCR. Heterologous befruktning reiser spørsmål på befruktning og kan brukes som et verktøy for å studere Kjønnscelle fysiologi og tidlig embryo utvikling. I tillegg viser suksessen til heterologous IVF potensialet i denne teknikken å teste dolphin sperm gjødsling kapasitet, som er verdt videre undersøkelser.
Introduction
Assistert reproduktive teknologier utvikles dårlig i ville dyr, inkludert marine pattedyr. Mangel på sensitive metoder for å vurdere sperm gjødslende suksess bidrar til langsom utvikling reproduktive teknologier i arter som dolphin. Det var ikke før nylig at grunnleggende banebrytende parameterne for Tumlar (bred snute truncatus) var rapportert1,2. Men gir variabler som motilitet og morfologi, selv om mye brukt, begrenset informasjon på reproduktive effektivitet. Den beste indikatoren for kvaliteten er evalueringen av gjødslende potensial.
Nylig brukt vår gruppe en metode for å vurdere dolphin sperm gjødsling potensial ved å vurdere mannlige pronuclear formasjon og/eller hybrid embryoet formasjon etter heterologous IVF bruke zona intakt bovin oocytes3. Bruk av delfin-storfe heterologous IVF har viktige fordeler over homologe IVF, som det overvinner vanskelighetene med å skaffe dolphin oocytes og forenkler bruken av godt testet i vitro bovin oocyte modning systemer. For å unngå arter spesifisitet, utføres heterologous befruktning vanligvis i fravær av ZP. Selv om det tillater for vurdering av muligheten for acrosome-reagert spermatozoa å fusjonere med eggeplomme membranen, svekker det evalueringen av andre funksjoner for befruktning. Fremgangsmåten bruker zona intakt oocytes og tillater evaluering av følgende parametere: sperm zona bindende og vedlegg, penetrasjon, polyspermy, pronuclear formasjon og hybrid embryoet cleavage.
Her presenterer vi flere protokoller for sæd samling, grunnleggende sperm analyse, spermatozoa fryser samt evaluering av dolphin sperm funksjonaliteten ved å vurdere mannlig pronuclear og/eller hybrid embryoet formasjon etter heterologous IVF bruke zona intakt storfe oocytes.
Protocol
Representative Results
Discussion
For mange forskjellige pattedyrarter finnes det ulike fordeler med å bruke frosne-tint sperm. Disse inkluderer muligheten til å overføre verdifulle genetisk materiale, potensialet for verdensomspennende distribusjon, lave risikoen for forurensning og evne til å bevare mannlige gameter i flere tiår. Bruk av cryopreserved sperm er viktig for Tumlar, fordi denne arten er beskyttet under vedlegg II av SITERER, som begrenser transport og utveksling av dyr mellom forskjellige vannparker. Delfiner transport er en aktivitet…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
hans arbeid ble finansiert av det spanske departementet for økonomi og konkurranseevne (AGL2015-70140-R til D. Rizos), AGL2015-66145R A. Gutierrez-Adan og J. F. Pérez-Gutiérrez og Seneca Foundation i Murcia (Grant 20040/BAKTERIE/16 til F. García-Vázquez)
Materials
| FERT-TALP medium | Merck | |
| TCM-199 | Sigma | M-4530 |
| Hoechst 33342 | Sigma | B-2261 |
| 4-well dishes | Nunc | 176740 |
| Density gradient BoviPure | Nidacon International | BP-100 |
| Washing solution Boviwash | Nidacon International | BW-100 |
| Magnesium chloride | Promega | A35 1H |
| Sterile water | Mili Q sintesis A10 Millipore | A35 1H |
| Buffer Tris Borate EDTA | Sigma | T4415 |
| MB agarose | Biotools | 20.012 |
| 5X GoTaq flexi buffer | Mili Q sintesis A10 Millipore | M 890 A |
| MB agarose | Biotools | 20.012 |
| Taq polymerase | Promega | |
| SafeView | NBS Biologicals Ltd. | M 890 A |
| Makler counting chamber | Sefi Medical | |
| Thoma chamber | Hecht-Assistant | |
| pHmeter MicropH 2000 | Crison Instruments | |
| Osmometer Advanced micro osmometer 3300 | Norwood | |
| Computer assisted sperm analysis system | Projectes y Serveis R+D | |
| Stereomicroscope MZ 95 | Leica | |
| Epifluorescent optics Eclipse Te300 | Nikon | |
| Confocal assistant 4.02 software | Bio-Rad | 3D analysis software |
| Confocal laser scanning microscopy | Bio-Rad | |
| Micropippetes (P2. P20, P200, P1000) | Gilson | |
| Microcentrifuge tubes | VWR | |
| UV iluminator | Bio-Rad | |
| PCR Thermal cycler Primus 96 Plus | MWG AG Biotech |
References
- Montano, G. A., et al. Evaluation of motility, membrane status and DNA integrity of frozen-thawed bottlenose dolphin (Tursiops truncatus) spermatozoa after sex-sorting and recryopreservation. Reproduction. 143 (6), 799-813 (2012).
- Sánchez-calabuig, M. J., et al. Validation of a field based chromatin dispersion assay to assess sperm DNA fragmentation in the bottlenose dolphin (Tursiops truncatus). Reprod Domest Anim. 49 (5), 761-768 (2014).
- Sánchez-calabuig, M. J., et al. Heterologous murine and bovine IVF using bottlenose dolphin (Tursiops truncatus) spermatozoa. Theriogenology. 84 (6), 983-994 (2015).
- Keller, K. V. Training of the Atlantic bottlenose dolphins (Tursiops truncatus) for artificial insemination. IAAAM. 14 (22), 22-24 (1986).
- Robeck, T. R., O’brien, J. K. Effect of cryopreservation methods and precryopreservation storage on bottlenose dolphin (Tursiops truncatus) spermatozoa. Biol Reprod. 70 (5), 1340-1348 (2004).
- Coy, P., et al. Hardening of the zona pellucida of unfertilized eggs can reduce polyspermic fertilization in the pig and cow. Reproduction. 135 (1), 19-27 (2008).
- Seager, S., W, G., Moore, L., Platz, C., Kirby, V. Semen collection (electroejaculation), evaluation and freezing in the Atlantic bottlenose dolphin (Tursiops truncatus). Proceedings of the American Association of Zoo Veterinarians. 136, (1981).
- Schroeder, J. P., Leatherwood, S., Reeves, R. R. Breeding Bottlenose Dolphins in captivity. The Bottlenose dolphin. , 447-460 (1990).
- Sánchez-Calabuig, M. J., et al. Effect of cryopreservation on the sperm DNA fragmentation dynamics of the bottlenose dolphin (Tursiops truncatus). Reprod Domest Anim. 50 (2), 227-235 (2015).
- Robeck, T. R., et al. Estrous cycle characterisation and artificial insemination using frozen-thawed spermatozoa in the bottlenose dolphin (Tursiops truncatus). Reproduction. 129 (5), 659-674 (2005).
- Robeck, T. R., et al. Development and evaluation of deep intra-uterine artificial insemination using cryopreserved sexed spermatozoa in bottlenose dolphins (Tursiops truncatus). Anim Reprod Sci. 139 (1-4), 168-181 (2013).
- Schroeder, J. P., Leatherwood, S., Reeves, R. R. Breeding Bottlenose Dolphins in captivity. The Bottlenose dolphin. , 447-460 (1990).
- Madeddu, M., et al. Effect of cooling rate on the survival of cryopreserved rooster sperm: Comparison of different distances in the vapor above the surface of the liquid nitrogen. Anim Reprod Sci. , (2016).
