הפקה מהירה מחיקת פטריות דרך<em> Agrobacterium</em> שינוי מתווך של OSCAR מחיקת מבנים
Summary
מוטנטים למחיקת גנים שנוצרו באמצעות רקומבינציה הומולוגית הם תקן הזהב למחקרי תפקוד גנים. OSCAR (שלב אחד בניה של Agrobacterium- רקומבינציה מוכנים פלסמידים) שיטה לדור מהיר של בונה המחיקה מתואר. Agrobacterium בתיווך טרנספורמציה פטרייתית הבא. לבסוף, שיטת אישור מבוסס PCR של מחיקות גנים transformants פטרייתי מוצג.
Abstract
מחיקה מדויקת של הגן (ים) של עניין, תוך השארת שאר הגנום ללא שינוי, מספקת את המוצר האידיאלי כדי לקבוע את תפקוד הגן המסוים באורגניזם החי. בפרוטוקול זה שיטת OSCAR של בנייה מדויקת ומהירה מחיקת פלסמיד מתואר. OSCAR מסתמך על מערכת שיבוט שבו תגובה רקומבינאז יחיד מתבצע המכיל את מטוהרים PCR- מוגבר 5 'ו 3' אגפים של הגן של עניין ושני פלסמידים, pA-Hyg OSCAR (וקטור הסמן) ו pOSCAR (הרכבה וֶקטוֹר). אישור של וקטור המחיקה התאספו כראוי מתבצעת על ידי מיפוי עיכול הגבלה ואחריו רצף. Agrobacterium tumefaciens משמש אז כדי לתווך המבוא של בניית המחיקה לתוך נבגים פטרייתיים (המכונה ATMT). לבסוף, assay PCR מתואר כדי לקבוע אם מבנה המחיקה משולבת על ידי רקומבינציה הומולוגיים או לא הומולוגיים, המציין מחיקת גנים אואינטגרציה ectopic, בהתאמה. גישה זו שימשה בהצלחה למחיקתם של גנים רבים ב- Verticillium dahliae וב- fusarium verticillioides בין מינים אחרים.
Introduction
דיסקציה גנטית היא מתודולוגיה רבת עוצמה לקביעת החשיבות הפונקציונלית של הפרט או שילובים של גנים. גישה סטנדרטית כדי להבין את התפקיד של גנים ספציפיים הוא ייצור של מוטציות גן יחיד ללא שינוי בכל גן אחר. הגישה החזקה ביותר והפחות מעורפלת עלולה להיות מחיקה מוחלטת ומדויקת של גן של מסגרת קריאה פתוחה (GOI ORF) ללא נזק לתפקוד גנטי אחר.
בגלל תקן קשירת גישות לדור פלסמיד המחיקה דורשים צעדים מרובים, רציונלי OSCAR 1 היה לייצר גישה מהירה יותר במבחנה . איור 1 מתאר את תהליך ההרכבה בגישת OSCAR. השיטה המתוארת כאן יש את היתרון של שילוב של בנייה מהירה של הפרט וקטורים למחיקת הגן בתגובת multipart יחיד בשילוב עם Agrobacterium tumefaciens הבאים בתיווך transfo(ATMT). OSCAR הוא מאוד מהיר ומשווה גם עם אסטרטגיות אחרות כגון שימוש הרכבה גיבסון בשמרים 2 . השיטה OSCAR שימש בהצלחה עם כמה מינים של פטריות מסוג Ascomycota. מינים אלה כוללים: fusarium verticillioides (לא פורסם), Verticillium dahliae 3 , Setosphaeria turcica 4 , Metarhizium robertsii 5 , Fusarium oxysporum f. Sp. Vasinfectum 6 , Pestalotiopsis microspora 7 , Colletotrichum higginsianum 8 , ו Dothistroma septosporum 9 ו Sarocladium zeae (לא פורסם) .
פרוטוקול זה מספק צעד אחר צעד הוראה עבור השיטה כולל עיצוב פריימר, הגברה ה- PCR הגברה, התגובה OSCAR BP, מחיקה מבנה מבנה אישור, transformatיון של Agrobacterium עם המבנה ואחריו העברת מבוסס ATMT של מבנה המחיקה לתוך התאים פטרייתי, ולבסוף הבחנה מוטציות מחיקה פטריות מאלה עם מבנים מחיקת משולב ectopically.
Protocol
Representative Results
Discussion
שלב אחד בניה של Agrobacterium -Recombination מוכן פלסמידים (OSCAR) הועסק בהצלחה עם מספר הולך וגדל של פטריות Ascomycota. השיטה צריכה גם להיות מיושם בקלות על Basidiomycota ו מינים אחרים phyla פטרייתי (עם היזמים המתאימים נהיגה לבחירה סמן גנים), בהנחה Agrobacterium בתיווך טרנספורמציה הומולוגיים רק?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים לסטודנטים הבאים לתואר ראשון ולתלמידי תיכון על עבודתם על מנת ליצור מוטציות של אוסקר ב Fusarium verticillioiodes : Anjellica Miller, Athar Naseer, Xiu Lin, Katelyn Woodbry, Chelsea Patterson, קתלין רוברטסון, קריסטינה ברדלי, אשטון רוג'רס, אלקסיס מקנזי, מני הרננדז , ג 'ף דלונג, כריסטיאן קינג, ג' י ג 'ונג, מריה בלדינג, כריסטי בור, דניאל O'Meara, לורן (ויקטוריה) קוק, ג' ייק גודמן, Sampriti דה, Oge Okoye, אליסה Beckstead, גארט היבס, ניק גולדשטיין, קרוליין Twum , כריס בנסון, לואיס סטוקס, האנה אייל, ג'יין הולסה, ג'סים מוחמד, ג'יימס לוגינס, קלי ראסל, גרינישה ג'ונס, קריסטין שאפר, מריאם חמאדי, אווה וילסון, קטרינה בזמור, טוני הארפר, קרלין מקגי, מוחמד מומין, רימה מומין , Thi Ngoc לה אנג'ל פאם.
Materials
| FungiDB | Database/ http://fungidb.org/fungidb/ | ||
| IDT PrimerQuest | IDT | Primer design online software/ http://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index | |
| Microsoft Word | Sequence file manipulation | ||
| Low Na LB Spec 100 medium | E. coli transformant selection, composition: 1% tryptone, 0.05% NaCl, 0.5% yeast extract, 1.5 % agar if for solid medium | ||
| Co-cultivation medium | ATMT transformation induction (Reference 12) | ||
| Aspergillus minimal medium with Hygromycin | Fungal transformant selection | ||
| PDA medium | Acumedia | 7149A | Single spore slant tubes |
| PDA-Hyg-Kan medium | Fungal ransformant isolation, PDA containing 150 μg/ml hygromycin B and 100 μg/ml Kanamycin; | ||
| Glass beads | Genlantis | C400100 | Plate spreading |
| Nitrocellulose filters (47mm) | Fisher | 09-719-555 | Co-culturing for ATMT |
| Various centifuge tubes | multiple preps | ||
| Petri plates (various) | Culturing of bacteria and Fungi | ||
| pA-Hyg OSCAR | Addgene | 29640 | Selectable marker vector |
| pOSCAR | Addgene | 29639 | Assembly vector |
| DH5a One Shot Competent E. coli cells | Life Technologies | 12297-016 | BP reaction transformation |
| ccdB survival E. coli cells | Life Technologies | A10460 | Maintenance of pOSCAR |
| Wooden transfer sticks | Colony streaking | ||
| Toothpicks | Colony picking | ||
| Microcentrifuge | Pelleting Bacteria etc | ||
| Preparative centrifuge | Fungal spore collection | ||
| Dissecting microscope | Single spore isolation | ||
| Automated Cell Counter | Spore suspension calculation | ||
| Compound microscope | Hemocytometer cell counting | ||
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | PCR gene flank produict purification |
| TaKaRa LA Taq | Takara Bio USA | RR002A | Hi Fidelity taq polymerase for OSCAR flank generation |
| Hygromycin B | InvivoGen | ant-hg-5 | |
| Spectinomycin | Sigma | 22189-32-8 | |
| Cefotaxim | TCI America | C2224 | |
| Moxalactam | Sigma-Aldrich | 43963 | |
| GelRed | Phenix Research Products | RGB-4103 | Post staining agarose gels |
| Qiagen QIAquick PCR Purification Kit (Cat. No. 28104) | |||
| (OneShot_ Mach1TM T1R or One Shot_ OmniMAX™ 2 T1R from Invitrogen) | Thermo Fisher Scientific | C862003 | |
| Gateway BP Clonase II Enzyme mix | Thermo Fisher Scientific | 11789020 | Used to assemble deletion construct in pOSAR |
| PrimerQuest tool | IDT | Used in step 1.4; available on http://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index |
References
- Paz, Z., García-Pedrajas, M. D., Andrews, D. L., Klosterman, S. J., Baeza-Montañez, L., Gold, S. E. One step construction of Agrobacterium-Recombination-ready-plasmids (OSCAR), an efficient and robust tool for ATMT based gene deletion construction in fungi. Fungal Genet Biol. 48 (7), 677-684 (2011).
- Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R. Y., Venter, J. C., Hutchison, C. A., Smith, H. O. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Klosterman, S. J., et al. Comparative genomics yields insights into niche adaptation of plant vascular wilt pathogens. PLoS Pathog. 7 (7), (2011).
- Xue, C., Wu, D., Condon, B. J., Bi, Q., Wang, W., Turgeon, B. G. Efficient gene knockout in the maize pathogen Setosphaeria turcica using Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation. Phytopathology. 103 (6), 641-647 (2013).
- Xu, C., et al. A high-throughput gene disruption methodology for the entomopathogenic fungus Metarhizium robertsii. PloS One. 9 (9), (2014).
- Crutcher, F. K., Liu, J., Puckhaber, L. S., Stipanovic, R. D., Bell, A. A., Nichols, R. L. FUBT, a putative MFS transporter, promotes secretion of fusaric acid in the cotton pathogen Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum. Microbiology. 161, 875-883 (2015).
- Yu, X., Wang, Y., Pan, J., Wei, D., Zhu, X. High frequency of homologous gene disruption by single-stranded DNA in the taxol-producing fungus Pestalotiopsis microspora. Ann Microbiol. 65 (4), 2151-2160 (2015).
- Korn, M., Schmidpeter, J., Dahl, M., Müller, S., Voll, L. M., Koch, C. A Genetic Screen for Pathogenicity Genes in the Hemibiotrophic Fungus Colletotrichum higginsianum Identifies the Plasma Membrane Proton Pump Pma2 Required for Host Penetration. PloS One. 10 (5), e0125960 (2015).
- Chettri, P. . Regulation of dothistromin toxin biosynthesis by the pine needle pathogen Dothistroma septosporum: a thesis presented in the partial fulfilment of the requirements for the degree of Doctor of Philosophy (PhD) in Genetics at Massey University, Manawatu, New Zealand . , (2014).
- Chen Zhou, ., Yujun Yang, ., Jong, A. Y. Mini-prep in ten minutes. Biotechniques. 8 (2), 172 (1990).
- Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. P Natl Acad SciUSA. 74 (12), 5463-5467 (1977).
- Khang, C. H., Park, S. Y., Rho, H. S., Lee, Y. H., Kang, S., Wang, K. a. n. Filamentous fungi (Magnaporthe grisea and Fusarium oxysporum). Agrobacterium Protocols. 2, 403-420 (2007).
- Zhang, Y. J., Zhang, S., Liu, X. Z., Wang Wen, H. A., M, A simple method of genomic DNA extraction suitable for analysis of bulk fungal strains. Lett Appl Microbiol. 51 (1), 114-118 (2010).
- Pluthero, F. G. Rapid purification of high-activity Taq DNA polymerase. Nucleic Acids Res. 21 (20), 4850-4851 (1993).
- McCluskey, K. Boosting Research and Industry by Providing Extensive Resources for Fungal Research. Gene Expression Systems in Fungi: Advancements and Applications. , 361-384 (2016).
