Ici, un échantillon de muscle quadriceps est prélevé sur un porc anesthésié et les mitochondries sont isolées par centrifugation différentielle. Ensuite, les fréquences respiratoires des complexes de la chaîne respiratoire mitochondriale I, II et IV sont déterminées à l’aide de la respirométrie à haute résolution.
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Article de méthode
Isolement des mitochondries Intact du muscle squelettique par centrifugation différentielle pour respirométriques mesures haute résolution
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les mitochondries sont impliquées dans le métabolisme énergétique cellulaire et utilisent l’oxygène pour produire de l’énergie sous forme d’adénosine triphosphate (ATP). La centrifugation différentielle à basse et haute vitesse est couramment utilisée pour isoler les mitochondries des tissus et des cellules en culture. Les fractions mitochondriales brutes obtenues par centrifugation différentielle sont utilisées pour les mesures de respirométrie. La technique de centrifugation différentielle est basée sur la séparation des organites en fonction de leur taille et de leur vitesse de sédimentation. L’isolement des mitochondries est effectué immédiatement après le prélèvement tissulaire. Le tissu est immergé dans un milieu d’homogénéisation glacé, haché à l’aide de ciseaux et homogénéisé dans un homogénéisateur en verre avec un pilon amovible. La technique de centrifugation différentielle est efficace, rapide et peu coûteuse et les mitochondries obtenues par centrifugation différentielle sont suffisamment pures pour les tests de respirométrie. Certaines des limites et des inconvénients des mitochondries isolées, basées sur la centrifugation différentielle, sont que les mitochondries peuvent être endommagées pendant la procédure d’homogénéisation et d’isolement et que de grandes quantités de biopsie tissulaire ou de cellules cultivées sont nécessaires pour l’isolement mitochondrial.
Introduction
bioénergétique mitochondrial et les capacités respiratoires peuvent être étudiés non seulement dans des cellules ou des fibres perméabilisées, mais aussi dans les mitochondries isolées. Dans la présente étude, nous décrivons un protocole pour isoler les mitochondries intactes du muscle squelettique en utilisant la centrifugation différentielle pour les mesures de respirométrie à haute résolution.
Pour isoler les mitochondries intactes pour respirométrie, le tissu est homogénéisé et les mitochondries sont isolées par un procédé de centrifugation différentielle classique. La méthode de centrifugation différentielle est basée sur centrifugat....
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Protocole
La biopsie du muscle quadriceps est prélevé à partir d'un porc anesthésié, à partir de laquelle les mitochondries sont isolées par centrifugation différentielle. Le cochon est utilisé par la suite pour une autre expérience. L'étude est réalisée en conformité avec les National Institutes of Health des lignes directrices pour les soins et l'utilisation des animaux de laboratoire et avec l'approbation du Comité du canton de Berne, Suisse Animal Care.
1. Skeletal Homogénéisation musculaire et mitochondrial Isolation
- Accise 5-10 échantillon g quadriceps musculaires à partir d'
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Résultats
Complexe I-dépendante la respiration
Taux isolés mitochondrial complexes I-dépendante des voies respiratoires (états 2, 3 et 4) sont déterminées à l' aide à haute résolution respirométrie (Figure 1, un schéma représentant). I substrats complexes mitochondriaux, le glutamate et le malate, sont ajoutés, suivis par l'addition d'ADP. L'état 2 se réfère à la consomm.......
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Discussion
Dans la présente étude, nous décrivons un protocole pour isoler de haute qualité, intact et étroitement couplées mitochondries des muscles squelettiques par centrifugation différentielle qui peuvent être utilisés pour des études fonctionnelles telles que haute résolution respirométrie.
Afin d'isoler les mitochondries intactes et étroitement couplées, il y a quelques points critiques à prendre en considération dans le présent protocole. Après avoir récolté le tissu osseux, il doit être im.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Cette étude a été soutenue par le Fonds national suisse (Subvention 32003B_127619).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| ADP | Sigma | A 4386 | Produit chimique |
| Antimycine A | Sigma | A 8674 | Produit chimique, dissous dans l’éthanol |
| Ascorbate | Merck | 1.00127 | Produit chimique |
| ATP | Sigma | A 7699 | Produit chimique |
| BSA | Sigma | A 6003 | Produit chimique |
| EGTA | fluka | 3779 | Chimique |
| Glutamate | Sigma,G | 1626 | Produit chimique |
| Hepes | Sigma | H 7523 | Chimique |
| KCl | Merck | 1.04936 | Chimique |
| KH2PO4 | Merck | 1.04873 | Chimique |
| K-lactobionate | Sigma | L 2398 | Chimique |
| MgCl2 | Sigma | M 9272 | Produit chimique |
| Acide morpholinopropane sulfonique (MOPS) | Merck | 1.06129 | Produit chimique |
| O2k-Core : Oxygraph-2k ; | Oroboros Instruments | 10000-02 | Instrument de respirométrie à haute résolution |
| Protéinase bactérienne | Sigma | P 8038 | Produit chimique |
| Azoture de sodium | Sigma | S2002 | Chimique |
| Roténone | Sigma | R 8875 | Produit chimique, dissous dans l’éthanol |
| Succinate | Sigma | S 2378 | Produit chimique |
| Schuett homogen-plus Homogénéisateur semi-automatique ; | schuett-biotec GmbH | 3.201 011 | Homogénéisateur de tissus |
| Taurine | Sigma | T 8691 | Produit chimique |
| TMPD | Sigma | T 3134 | Chimique |
Références
- Hogeboom, G. H., Schneider, W. C., Pallade, G. E. Cytochemical studies of mammalian tissues. I. Isolation of intact mitochondria from rat liver; some biochemical properties of mitochondria and submicroscopic particulate material. J. Biol. Chem. 172, 619-635 (1948).
- Sims, N. R.
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Réimpressions et autorisations
