Visadas<em> In Situ</em> mutagénese de histona Genes em brotamento Yeast
Summary
A strategy for generating mutations in histone genes at their endogenous location in Saccharomyces cerevisiae is presented.
Abstract
We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting mutant alleles reside at their endogenous genomic sites and no exogenous DNA sequences are left in the genome following the procedure. Since in haploid yeast cells each of the four core histone proteins is encoded by two non-allelic genes with highly homologous open reading frames (ORFs), targeting mutagenesis specifically to one of two genes encoding a particular histone protein can be problematic. The strategy we describe here bypasses this problem by utilizing sequences outside, rather than within, the ORF of the target genes for the homologous recombination step. Another feature of this system is that the regions of DNA driving the homologous recombination steps can be made to be very extensive, thus increasing the likelihood of successful integration events. These features make this strategy particularly well-suited for histone gene mutagenesis, but can also be adapted for mutagenesis of other genes in the yeast genome.
Introduction
Os quatro proteínas histonas centrais H2A, H2B, H3, H4 e desempenham papéis centrais na compactação, organização e função dos cromossomas eucarióticos. Dois conjuntos de cada uma destas histonas formar o octâmero da histona, um carretel molecular que dirige o invólucro de ~ 147 pares de bases de ADN em torno de si, resultando na formação de um nucleossoma 1. Nucleossomas são agentes activos numa variedade de processos à base de cromossomas, tais como a regulação da transcrição de genes e a formação de eucromatina e heterocromatina entre cromossomas, e, como tal, têm sido o foco de intensa investigação ao longo de várias décadas passadas. Um número de mecanismos têm sido descritos por nucleossomas que podem ser manipulados em formas que podem facilitar a execução dos processos específicos – estes mecanismos de modificação pós-tradução incluem os resíduos de histonas, remodelar nucleossoma dependente de ATP, e reorganização nucleossoma ATP-independentee montagem / desmontagem 2, 3.
A levedura de germinação Saccharomyces cerevisiae é um organismo particularmente poderoso modelo para a compreensão da função da histona em eucariotas. Isto pode ser em grande parte atribuído ao elevado grau de conservação evolutiva das proteínas histona eukarya todo o domínio e a receptividade de levedura para uma variedade de genética e bioquímica experimental aproxima 4. abordagens Reverse-genéticos nas leveduras têm sido amplamente utilizada para estudar os efeitos de mutações específicas de histona sobre vários aspectos da biologia da cromatina. Para estes tipos de experiências é frequentemente preferível a utilização de células em que as histonas mutantes são expressos a partir de loci genómico nativo, como a expressão a partir de plasmídeos autónomos podem levar a níveis anormais intracelular de proteínas histona (devido a diferentes números de plasmídeos em células) e alteração concomitante da cromatina enam-, que em última instância pode confundir a interpretação dos resultados.
Aqui, nós descrevemos uma técnica baseada em PCR que permite a mutagénese direccionada de genes de histonas nas suas localizações genómicas nativas, que não requerem um passo de clonagem e resulta na produção da mutação (ões) desejada, sem sequências de ADN exógeno que sobram no genoma. Esta técnica tira proveito do sistema de recombinação homóloga eficiente em levedura e tem várias características em comum com outras técnicas semelhantes desenvolvidas por outros grupos – mais notavelmente o Delitto Perfetto, genômica mutagénese específica (SSG), e alelo à base de PCR clonagem-livre métodos de reposição de 5, 6, 7. No entanto, a técnica que descrevem tem um aspecto que o torna particularmente adequado para a mutagénese de genes de histonas. Em células de levedura haplóides, cada um dos quatro histonas nucleares é codificada por dois não-Agenes llelic e altamente homólogas: por exemplo, histona H3 é codificado pelos genes HHT1 e HHT2, e as grelhas de leitura abertas (ORFs) dos dois genes são mais de 90% idênticos na sequência. Este elevado grau de homologia pode complicar experiências concebidas para visar especificamente um dos dois genes codificadores de histonas para mutagénese. Considerando que os métodos acima mencionados exigem frequentemente a utilização de, pelo menos, algumas sequências dentro da ORF do gene alvo para dirigir recombinação homóloga, a técnica aqui descrita faz uso das sequências que flanqueiam as ORFs dos genes de histonas (que partilhem menos homologia de sequência) para o passo de recombinação, aumentando assim a probabilidade de sucesso de mutagénese direccionamento ao local desejado. Além disso, as regiões homólogas que impulsionam a recombinação pode ser muito extensa, contribuindo para a eficiente recombinação homóloga alvo.
Protocol
Representative Results
Discussion
O nível elevado de homologia de sequências entre os dois genes não alélicos que codificam para cada uma das quatro proteínas histona de núcleo em células haplóides de S. cerevisiae pode representar um desafio para os investigadores que desejam atingir especificamente um dos dois genes para a mutagénese. Anteriormente descreveu metodologias de mutagénese de levedura, incluindo a Delitto Perfetto, genómico de mutagénese específica do local (SSG), e métodos de substituição alelo baseada em…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Reine Protacio for helpful comments during the preparation of this manuscript. We express our gratitude to the National Science Foundation (grants nos. 1243680 and 1613754) and the Hendrix College Odyssey Program for funding support.
Materials
| 1 kb DNA Ladder (DNA standards) | New England BioLabs | N3232L | |
| Agarose | Sigma | A5093-100G | |
| Boric Acid | Sigma | B0394-500G | |
| dNTP mix (10 mM each) | ThermoFisher Scientific | R0192 | |
| EDTA solution (0.5M, pH 8.0) | AmericanBio | AB00502-01000 | |
| Ethanol (200 Proof) | Fisher Scientific | 16-100-824 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma | E4884-500G | |
| Lithium acetate dihydrate | Sigma | L6883-250G | |
| MyCycler Thermal Cycler | BioRad | 170-9703 | |
| Poly(ethylene glycol) (PEG) | Sigma | P3640-1KG | |
| PrimeSTAR HS DNA Polymerase (high fidelity DNA polymerase) and 5X buffer | Fisher Scientific | 50-443-960 | |
| Salmon sperm DNA solution | ThermoFisher Scientific | 15632-011 | |
| Sigma 7-9 (Tris base, powder form) | Sigma | T1378-1KG | |
| Sodium acetate trihydrate | Sigma | 236500-500G | |
| Supra Sieve GPG Agarose (low metling temperature agarose) | AmericanBio | AB00985-00100 | |
| Taq Polymerase and 10X Buffer | New England BioLabs | M0273X | |
| Toothpicks | Fisher Scientific | S67859 | |
| Tris-HCl (1M, pH 8.0) | AmericanBio | AB14043-01000 | |
| a-D(+)-Glucose | Fisher Scientific | AC170080025 | for yeast media |
| Agar | Fisher Scientific | DF0140-01-0 | for yeast media |
| Peptone | Fisher Scientific | DF0118-07-2 | for YPD medium |
| Yeast Extract | Fisher Scientific | DF0127-17-9 | for YPD medium |
| 4-aminobenzoic acid | Sigma | A9878-100G | for complete minimal dropout medium |
| Adenine | Sigma | A8626-100G | for complete minimal dropout medium |
| Glycine hydrochloride | Sigma | G2879-100G | for complete minimal dropout medium |
| L-Alanine | Sigma | A7627-100G | for complete minimal dropout medium |
| L-Arginine monohydrochloride | Sigma | A5131-100G | for complete minimal dropout medium |
| L-Asparagine monohydrate | Sigma | A8381-100G | for complete minimal dropout medium |
| L-Aspartic acid sodium salt monohydrate | Sigma | A6683-100G | for complete minimal dropout medium |
| L-Cysteine hydrochloride monohydrate | Sigma | C7880-100G | for complete minimal dropout medium |
| L-Glutamic acid hydrochloride | Sigma | G2128-100G | for complete minimal dropout medium |
| L-Glutamine | Sigma | G3126-100G | for complete minimal dropout medium |
| L-Histidine monohydrochloride monohydrate | Sigma | H8125-100G | for complete minimal dropout medium |
| L-Isoleucine | Sigma | I2752-100G | for complete minimal dropout medium |
| L-Leucine | Sigma | L8000-100G | for complete minimal dropout medium |
| L-Lysine monohydrochloride | Sigma | L5626-100G | for complete minimal dropout medium |
| L-Methionine | Sigma | M9625-100G | for complete minimal dropout medium |
| L-Phenylalanine | Sigma | P2126-100G | for complete minimal dropout medium |
| L-Proline | Sigma | P0380-100G | for complete minimal dropout medium |
| L-Serine | Sigma | S4500-100G | for complete minimal dropout medium |
| L-Threonine | Sigma | T8625-100G | for complete minimal dropout medium |
| L-Tryptophan | Sigma | T0254-100G | for complete minimal dropout medium |
| L-Tyrosine | Sigma | T3754-100G | for complete minimal dropout medium |
| L-Valine | Sigma | V0500-100G | for complete minimal dropout medium |
| myo-Inositol | Sigma | I5125-100G | for complete minimal dropout medium |
| Uracil | Sigma | U0750-100G | for complete minimal dropout medium |
| Ammonium Sulfate | Fisher Scientific | A702-500 | for complete minimal dropout medium |
| Yeast Nitrogen Base | Fisher Scientific | DF0919-07-3 | for complete minimal dropout medium |
| 5-Fluoroorotic acid (5-FOA) | AmericanBio | AB04067-00005 | for 5-FOA medium |
References
- Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).
- Campos, E. I., Reinberg, D. Histones: annotating chromatin. Annu Rev Genet. 43, 559-599 (2009).
- Rando, O. J., Winston, F. Chromatin and transcription in yeast. Génétique. 190 (2), 351-387 (2012).
- Duina, A. A., Miller, M. E., Keeney, J. B. Budding yeast for budding geneticists: a primer on the Saccharomyces cerevisiae model system. Génétique. 197 (1), 33-48 (2014).
- Storici, F., Resnick, M. A. Delitto perfetto targeted mutagenesis in yeast with oligonucleotides. Genet Eng (N Y). 25, 189-207 (2003).
- Gray, M., Kupiec, M., Honigberg, S. M. Site-specific genomic (SSG) and random domain-localized (RDL) mutagenesis in yeast. BMC Biotechnol. 4, 7 (2004).
- Erdeniz, N., Mortensen, U. H., Rothstein, R. Cloning-free PCR-based allele replacement methods. Genome Res. 7 (12), 1174-1183 (1997).
- Brachmann, C. B., et al. Designer deletion strains derived from Saccharomyces cerevisiae S288C: a useful set of strains and plasmids for PCR-mediated gene disruption and other applications. Yeast. 14 (2), 115-132 (1998).
- Lundblad, V., Hartzog, G., Moqtaderi, Z. Manipulation of cloned yeast DNA. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 13, (2001).
- Hoffman, C. S. Preparation of yeast DNA. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 13, (2001).
- Treco, D. A., Lundblad, V. Preparation of yeast media. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 13, (2001).
- Lederberg, J., Lederberg, E. M. Replica plating and indirect selection of bacterial mutants. J Bacteriol. 63 (3), 399-406 (1952).
- Sikorski, R. S., Hieter, P. A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae. Génétique. 122 (1), 19-27 (1989).
- Johnson, P., et al. A systematic mutational analysis of a histone H3 residue in budding yeast provides insights into chromatin dynamics. G3 (Bethesda). 5 (5), 741-749 (2015).
- DiCarlo, J. E., et al. Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems. Nucleic Acids Res. 41 (7), 4336-4343 (2013).
- Cross, S. L., Smith, M. M. Comparison of the structure and cell cycle expression of mRNAs encoded by two histone H3-H4 loci in Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol. 8 (2), 945-954 (1988).
- Libuda, D. E., Winston, F. Amplification of histone genes by circular chromosome formation in Saccharomyces cerevisiae. Nature. 443 (7114), 1003-1007 (2006).
