Effektiv Differentiering av pluripotenta stamceller till NKX6-1⁺ Pankreasstamfäder

Summary

Här beskriver vi en 4-stegs-protokollet för att skilja mänskliga embryonala stamceller till NKX6-1 ⁺ bukspottkörteln stamceller in vitro. Detta protokoll kan tillämpas på en mängd olika humana pluripotenta stamcellinjer.

Abstract

Pluripotenta stamceller har förmågan att själv förnya och differentiera till flera härstamningar, vilket gör dem till en attraktiv källa för generering av pankreatiska progenitorceller som kan användas för att studera och framtida behandling av diabetes. Denna artikel beskriver en fyrstegs differentiering protokoll som syftar till att generera bukspottkörteln progenitorceller från mänskliga embryonala stamceller (hESCs). Detta protokoll kan tillämpas på ett antal humana pluripotenta stamcell (hPSC) linjer. Tillvägagångssättet för att generera bukspottkörteln progenitorceller är att differentiera hESCs att noggrant modellera viktiga skeden av bukspottskörteln utveckling. Detta börjar med induktionen av den slutgiltiga endoderm, vilket uppnås genom odling av cellerna i närvaro av Aktivin A, basisk fibroblasttillväxtfaktor (bFGF) och CHIR990210. Ytterligare differentiering och mönstring med fibroblasttillväxtfaktor 10 (FGF10) och Dorsomorphin genererar celler som liknar den bakre foregut. Tillsatsen av Retinsyra, SKALLE, SANT-1 och FGF10 skiljer bakre foregut celler till celler som är karakteristiska för pankreas endoderm. Slutligen, en kombination av epidermal tillväxtfaktor (EGF), Nikotinamid och SKALLE leder till den effektiva genereringen av PDX1 ⁺ / NKX6-1 ⁺ -celler. Flödescytometri utförs för att bekräfta uttrycket av specifika markörer i viktiga skeden av bukspottskörteln utveckling. De PDX1 ⁺ / NKX6-1 ⁺ bukspottkörteln stamceller i slutet av etapp 4 kan generera mogna p-celler vid transplantation i möss med immunbrist och kan differentieras ytterligare för att generera insulinproducerande celler in vitro. Således, en effektiv generering av PDX1 ⁺ / NKX6-1 ⁺ bukspottkörteln stamceller, vilket framgår i detta protokoll, är av stor betydelse eftersom det ger en plattform för att studera human pankreas utveckling in vitro och ger en källa av celler med potential att differentiera till p-celler som skulle kunna eVentually användas för behandling av diabetes.

Introduction

Prevalensen av diabetes ökar och enligt den kanadensiska Diabetes Association, är det uppskattas att över 11 miljoner människor i Kanada är diabetiker eller prediabetic, med 5-10% av dessa individer med typ 1 diabetes (T1D) ^1. T1D är en autoimmun sjukdom som orsakas av förstörelsen av de insulinproducerande P-celler som finns inom de Langerhanska öarna. För närvarande individer som bor med T1D kräver exogena källor av insulin ^två. Trots framsteg inom insulinterapi, T1D patienter fortsätter att ha en svår tid att reglera sina blodglukosnivåer och fortsätta att lida både hypo- och hyperglykemi. En lovande behandlingsform för att återställa normoglykemi i T1D är användningen av mänskliga embryonala stamceller (hESCs), som kan användas för att generera ett obegränsat utbud av insulinproducerande P-celler både in vivo och in vitro ^3, <supp class = "xref"> ^{4, 5, 6, 7.} Skilja hESCs till p-liknande celler skulle kunna göra det möjligt att studera diabetes in vitro, vilket möjliggör identifiering av nya terapeutiska mål för typ 2-diabetes och ge celler för transplantation i T1D patienter.

Den mest framgångsrika försöket att alstra insulinproducerande celler från hESCs in vitro är att rekapitulera de embryonala händelser som inträffar under pankreatisk utveckling ^{4, 5.} Detta innebär manipulering av olika signalvägar för att noggrant modellera viktiga steg i utvecklings bukspottkörteln. Pankreatisk utveckling börjar med induktionen av den slutgiltiga endoderm, vilket kännetecknas av uttrycket av CXCR4 och CD117 (c-KIT) ^{8, 9.} Exakt reglering av Definitive endoderm organisation krävs för bildningen av tarmröret, som därefter undergår anterior-till-bakre och ventral-dorsal mönstring. Rygg och ventrala bukspottkörteln knoppar ut från området av den bakre foregut som uttrycker bukspottskörteln och duodenal homeobox genen (Pdx1), vilket är nödvändigt för pancreatic utveckling ^10. Rygg och ventrala knoppar säkring för att bilda bukspottkörteln, som sedan genomgår omfattande epitel ombyggnad och utbyggnad ^11. Engagemang för det endokrina och exokrina härstamning åtföljs av generering av multi progenitorceller (partnerländerna) som uttrycker bland annat transkriptionsfaktorer Pdx1, Nkx6.1 och Ptf1a ^{12, 13.} Partnerländerna som kommer att bli endokrina och duktala celler fortsätter att uttrycka Nkx6-1 samtidigt minska Ptf1a uttryck. I motsats till detta kommer exokrina härstamning celler förlorar expression av Nkx6-1 och upprätthålla Ptf1a uttryck ^12.

Transkriptionsfaktom Nkx6-1 har en nyckelroll i pankreatisk utveckling, särskilt under differentiering av endokrina stamfaderceller till p-celler. Som tidigare beskrivits, radering av Nkx6-1 resulterar i nedsatt bildning av p-celler under pankreatisk utveckling ^14. Därför genererar insulinproducerande P-celler både in vitro och in vivo kräver effektiv induktion av Nkx6-1.

Vi utvecklade nyligen ett protokoll för att effektivt generera PDX1 ⁺ / NKX6-1 ⁺ bukspottkörteln stamceller från hPSCs. Dessa hPSC-härledda pankreatiska progenitorceller generera mogna p-celler vid transplantation till immundefekta möss ^3. Differentieringen protokollet kan delas in i fyra stadier kännetecknande för: 1) definitiv endoderm induktion, 2) bakre foregut mönstring, 3) pancreatic specifikation och 4) NKX6-1 induktion. Här ger vi en detaljerad beskrivning av varje steg i den riktade differentiering.

Protocol

1. Beredning av lösningar och media OBS: Förbered alla medier för cellkultur i en steril miljö. Media måste göras och användas omedelbart. Reagens detaljer ges i materialtabellen. differentiering Media Förbereda Dag 0 Differentiering Media: RPMI Medium med 1% glutamin, 2 | iM CHIR 99021, 100 ng / ml Aktivin A, 10 4 M MTG. Förbereda Dag 1-2 Differentiering Media: RPMI Medium med 1% glutamin, 100 ng / ml Aktivi…

Representative Results

Effektiv generering av pankreatiska progenitorceller är beroende av korrekt tillväxt och underhåll av odifferentierade celler följt av den exakta tillsatsen av specifika signalmolekyler under differentieringsprotokoll, såsom illustreras i den schematiska i fig 1A. På dag 0, bör odifferentierade celler vara 80-95% sammanflytande och kolonier ska ha definierade kanter (Figur 1A). Under etapp 1 kommer medierna sannolikt grumliga eftersom celldöd är…

Discussion

Framgångsrikt genererar NKX6-1 ⁺ bukspottkörteln stamceller från hPSCs in vitro bygger på användning av högkvalitativa kulturer av hPSCs och riktad differentiering som omfattar exakt reglering av specifika signalvägar som styr viktiga utvecklingsstadier under pankreatisk utveckling. Även om detta protokoll kan användas för att inducera robust uttryck av NKX6-1 över en mängd olika hPSC linjer som tidigare visats ^3, för att säkerställa en effektiv NKX6-1 generatio…

Materials

Media and cytokines
1-Thioglycerol (MTG)	Sigma	M6145
Activin A	R&D	338-AC/CF
Ascorbic Acid	Sigma	A4544
B-27 Supplement	Life Technologies	12587-010
BD Cytofix/Cytoperm Buffer	BD Bioscience	554722
BD Perm/Wash buffer, 1x	BD Bioscience	554723
bFGF	R&D	233-FB
CHIR990210	Tocris	4423a
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	Life Technologies	11995
DNase I	VWR	80510-412
Dorsomorphin	Sigma	P5499
EGF	R&D	236-EG
Fetal Bovine Serum (FBS)	Wisent	88150
FGF10	R&D	345-FG
Gelatin from porcine skin	Sigma	G1890
Glutamine	Life Technologies	25030
Nicotinamide	Sigma	NO636
NOGGIN	R&D	3344-NG
Penicillin/Streptomycin	Life Technologies	15070-063
Retinoic acid	Sigma	R2625
RPMI Medium 1640	Life Technologies	11875
SANT-1	Tocris	1974
TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red	Life Technologies	12605-010
Name	Company	Catalogue Number	Comments
Antibodies for flow cytometry (working dilutions)
CD117 PE (1:100)	Life Technologies	CD11705
CXCR4 APC (1:50)	BD  Bioscience	551966
Donkey Anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 647 conjugate (1:400)	Life Technologies	A-31571
Donkey Anti-Goat IgG (H+L), Alexa Fluor 488 (1:400)	Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.	705-546-147
Isotype Control Mouse IgG	Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.	015-000-003
Isotype Control Goat IgG	R&D	AB-108-C
NKX6-1 (1:2000)	DSHB	F55A10
PDX1 (1:100)	R&D	AF2419