Intracellulaires Coloration et cytométrie de flux pour identifier lymphocytaires sous-ensembles au sein murin Aorte, Reins et les ganglions lymphatiques dans un modèle de l&#39;hypertension

Fanny Laroumanie; Bethany L. Dale; Mohamed A. Saleh; Meena S. Madhur

doi:10.3791/55266

Article de méthode

Intracellulaires Coloration et cytométrie de flux pour identifier lymphocytaires sous-ensembles au sein murin Aorte, Reins et les ganglions lymphatiques dans un modèle de l'hypertension

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DOI :

10.3791/55266

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28 janvier 2017

Fanny Laroumanie¹ , Bethany L. Dale² , Mohamed A. Saleh³ , Meena S. Madhur¹

¹Department of Medicine, Division of Clinical Pharmacology, Vanderbilt University Medical Center, ²Department of Molecular Physiology and Biophysics, Vanderbilt University, ³Department of Pharmacology and Toxicology, Faculty of Pharmacy, Mansoura University

Dans cet article

Résumé

Cet article fournit une méthodologie détaillée pour identifier et quantifier les sous-ensembles de lymphocytes T fonctionnels présents dans les ganglions rénaux murin, l'aorte et lymphatiques par coloration intracellulaire et cytométrie de flux. Le modèle de l'angiotensine II hypertension induite a été choisi pour expliquer, étape par étape, les procédures et les principes fondamentaux de la cytométrie de flux et de coloration intracellulaire.

Résumé

Il est maintenant bien connu que les lymphocytes T jouent un rôle essentiel dans le développement de plusieurs maladies cardiovasculaires^1,2,3,4,5. Par exemple, des études de notre groupe ont montré que l’hypertension est associée à une accumulation excessive de lymphocytes T dans les vaisseaux et les reins lors du développement de l’hypertension expérimentale⁶. Une fois dans ces tissus, les lymphocytes T produisent plusieurs cytokines qui affectent à la fois la fonction vasculaire et rénale, entraînant une vasoconstriction et une rétention de sodium et d’eau^1,2. Pour bien comprendre comment les lymphocytes T causent les maladies cardiovasculaires et rénales, il est important de pouvoir identifier et quantifier les sous-ensembles spécifiques de lymphocytes T présents dans ces tissus. Les sous-ensembles de lymphocytes T sont définis par une combinaison de marqueurs de surface, de cytokines qu’ils sécrètent et de facteurs de transcription qu’ils expriment. La complexité de la population de lymphocytes T fait de la cytométrie en flux et de la coloration intracellulaire une technique inestimable pour disséquer les phénotypes des lymphocytes présents dans les tissus. Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour identifier les marqueurs de surface et intracellulaires (cytokines et facteurs de transcription) dans les cellules T isolées des reins, de l’aorte et des ganglions lymphatiques drainants aortiques murins dans un modèle d’hypertension induite par l’angiotensine II. Les étapes suivantes sont décrites en détail : isolement des tissus, génération des suspensions unicellulaires, stimulation ex vivo, fixation, perméabilisation et coloration. De plus, plusieurs principes fondamentaux des analyses cytométriques en flux, y compris le choix des contrôles appropriés et des stratégies de contrôle appropriées, sont abordés.

Introduction

Des données récentes démontrent que le système immunitaire adaptatif, en particulier les lymphocytes T jouent un rôle crucial dans le développement de plusieurs maladies cardiovasculaires ^1,2,3,4,5. Par exemple, dans le modèle de l' angiotensine II , l' hypertension induite par une accumulation de lymphocytes T dans les vaisseaux et les reins de souris a été décrite ^6. L'accumulation vasculaire est principalement dans l'adventice et la graisse périvasculaire. Dans le rein, les cellules T accumulent à la fois dans la moelle et le cortex rénal. Selon le type de sous - ensemble est en cause, ces cellules T donnent naissance à différ....