Murine lymphocytaire par étiquetage<sup> 64</sup> Cu-anticorps du récepteur de ciblage pour<em> In Vivo</em> Le trafic cellulaire par PET / CT
Summary
Suite à la préparation d'un 64 anticorps monoclonal Cu-modifié de liaison à un récepteur de cellule T murine transgénique, les cellules T sont radiomarqué in vivo, une analyse de la viabilité, la fonctionnalité, la stabilité du marquage et de l' apoptose, et par transfert adoptif dans des souris avec une voie aérienne d'hypersensibilité de type retardé réaction pour l'imagerie non invasive par tomographie par émission de positons / tomodensitométrie (PET / CT).
Abstract
Ce protocole illustre la production de 64 Cu et la conjugaison chélateur / radiomarquage d'un anticorps monoclonal (mAb) , suivie d' une culture de cellules de lymphocytes murins et 64 récepteur Cu-anticorps ciblant des cellules. Dans l' évaluation in vitro du radiomarqueur et non-invasive dans le suivi des cellules in vivo dans un modèle animal d'une voie aérienne d' hypersensibilité retardée réaction (DTHR) par PET / CT sont décrites.
Dans le détail, la conjugaison d'un anticorps monoclonal avec l'agent chélatant acide 1,4,7,10-tétraazacyclododécane-1,4,7,10-tétraacétique (DOTA) est représenté. Suite à la production de 64 radioactif Cu, le radiomarquage de l'anticorps monoclonal DOTA-conjugué est décrite. Ensuite, l'expansion de l' ovalbumine de poulet (COVA) CD4 + interféron spécifique de (IFN) -γ-production de cellules T auxiliaires (Cova-TH1) et la radiomarquage subséquente des cellules Cova-TH1 sont représentés. Diverses techniques in vitro sont présentées pour évaluer l'effets de 64 Cu-radiomarquage sur les cellules, telles que la détermination de la viabilité des cellules par exclusion au bleu trypan, la coloration de l' apoptose avec l' Annexine V pour la cytométrie en flux, et l'évaluation de la fonctionnalité par un dosage immuno-enzymatique IFN-γ (ELISA) . En outre, la détermination de l'absorption radioactive dans les cellules et la stabilité de l'étiquetage sont décrites en détail. Ce protocole décrit en outre comment effectuer des études de suivi de cellules dans un modèle animal pour une DTHR des voies respiratoires et, par conséquent, l'induction de DHTR aiguë des voies aériennes induite par COVA dans des souris BALB / c est inclus. Enfin, un flux de travail TEP / CT robuste comprenant l'acquisition d'image, la reconstruction, et l'analyse est présentée.
Le 64 récepteur de Cu-anticorps approche de ciblage avec l' internalisation du récepteur ultérieur fournit une spécificité élevée et la stabilité, réduit la toxicité cellulaire, et de faibles taux d'efflux par rapport au PET traceurs communs pour le marquage cellulaire, par exemple 64 Cu-pyruvaldehyde bis (N4-méthylthiosemicarbazone) (64 Cu-PTSM). Enfin, notre approche permet non-invasive in vivo suivi des cellules en PET / CT avec un rapport optimal signal-sur-fond pendant 48 heures. Cette approche expérimentale peut être transférée à différents modèles animaux et types de cellules avec les récepteurs liés à la membrane qui sont internalisés.
Introduction
Le suivi des cellules non-invasive est un outil polyvalent pour surveiller la fonction cellulaire, la migration et homing in vivo. De récentes études de suivi de cellules se sont concentrées sur mésenchymateuses 1, 2 ou cellules souches dérivées de la moelle osseuse 3 dans le cadre de la médecine régénérative, les globules blancs périphériques autologues dans l' inflammation ou des lymphocytes T dans des thérapies cellulaires adoptifs contre le cancer 3, 4. L'élucidation des sites d'action et les principes biologiques sous-jacents des thérapies à base de cellules est d'une importance énorme. CD8 + lymphocytes T cytotoxiques, récepteur de l' antigène chimère génétiquement modifiées (CAR) des cellules T ou des lymphocytes infiltrant les tumeurs (TIL) ont été largement considéré comme l'étalon-or. Cependant, les cellules TH1 spécifiques de l' antigène associé à la tumeur se sont révélés être une option de traitement alternative efficace 4, </ sup> 5, 6, 7.
Comme les principaux acteurs dans l' inflammation, les maladies auto – immunes spécifiques d'organes (par exemple, la polyarthrite rhumatoïde ou d' asthme bronchique), et les cellules de grand intérêt pour l' immunothérapie du cancer, il est important de caractériser les modes de distribution et de homing temporelles des cellules TH1. L' imagerie in vivo non invasive par TEP présente une quantitative, une méthode très sensible 8 pour examiner les schémas de migration des cellules, dans la prise d' origine in vivo, et les sites d'action des lymphocytes T et des réponses au cours de l' inflammation, les allergies, les infections ou le rejet de la tumeur 9, 10, 11.
Cliniquement, 111 In-oxine est utilisé pour la scintigraphie des leucocytes pour la discrimination de l' inflammation et de l' infection 12, tandis que le 2-désoxy-2- (18F) fluoro-D-glucose (18 F-FDG) est couramment utilisé pour les études de suivi des cellules en PET 3, 13. Un inconvénient majeur de ce traceur PET, cependant, est la courte demi-vie du radionucléide 18 F à 109,7 min et la faible stabilité intracellulaire qui empêche l' imagerie aux points de temps plus tard transfert post cellulaire adoptive. Pour plus long terme in vivo des études de suivi de cellules par PET, bien instable dans les cellules, 64 Cu-PTSM est fréquemment utilisé pour étiqueter de façon non spécifique des cellules 14, 15 avec des effets néfastes réduits au minimum sur la viabilité des cellules T et la fonction 16.
Ce protocole décrit un procédé pour réduire davantage les effets désavantageux sur la viabilité cellulaire et la fonction à l'aide d'un récepteur de cellule T (TCR) de mAb radiomarquée spécifique de. Premièrement, la production du radio – isotope 64 Cu, la conjugaison du mAb avec KJ1-26 ee chélateur DOTA, et le 64 Cu-radiomarquage ultérieur sont présentés. Dans une deuxième étape, l'isolement et l' expansion de cellules Cova-TH1 de souris donneuses DO11.10 et le radiomarquage avec sont décrits en détail 64 mAb conjugué DOTA-Cu chargé KJ1-26 (64 Cu-DOTA-KJ1-26). L'évaluation des valeurs absorption et l' efflux de la radioactivité avec un calibrateur de dose et par y-comptage, respectivement, ainsi que l'évaluation des effets de 64 Cu-radiomarquage sur la viabilité des cellules par exclusion au bleu trypan et de fonctionnalité avec ELISA de IFN-y sont présentés . Pour les non-invasive dans le suivi des cellules in vivo, le déclenchement d'un modèle de souris de DTHR voies aériennes aiguë induite par Cova et l' acquisition d' image par PET / CT après le transfert cellulaire adoptive sont décrits.
De plus, cette approche de l'étiquetage peut être transférée à différents modèles de la maladie, les cellules T de souris avec différentes cellules ou RLT d'intérêt général avec les récepteurs liés à la membrane ou l'expression markers membrane continue qui sous – tend la navette 17.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole présente une méthode fiable et facile à radiomarquer de manière stable des cellules pour le suivi in vivo par TEP. En utilisant cette méthode, les cellules Cova-TH1, isolé et élargi in vitro à partir de souris donneuses, pourrait être radiomarqués avec 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb et leur prise d' origine a été suivi pour les ganglions pulmonaires et périthymique en tant que sites de présentation dans une Cova Cova induite par DTHR des voies aériennes aiguës.
<p…Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient le Dr Julia Mannheim, Walter Ehrlichmann, Ramona Stumm, Funda Cay, Daniel Bukala, Maren Harant ainsi que Natalie Altmeyer pour le soutien lors de l'analyse des expériences et des données. Ce travail a été soutenu par Werner Siemens-Fondation, la DFG par le SFB685 (projet B6) et FORTUNE (2309-0-0).
Materials
| HCl, Suprapur | Merck, Darmstadt, Germany | 1.00318 | 64Cu production |
| Methanol, Suprapur | Merck, Darmstadt, Germany | 1.06007 | 64Cu production |
| Isopropanol, Suprapur | Merck, Darmstadt, Germany | 1.0104 | 64Cu production |
| Pt/Ir (90/10) plate | Ögussa | Custom made | 64Cu production |
| PEEK chamber | Ögussa | Custom made | 64Cu production |
| 64Ni | Chemotrade | 64Cu production | |
| Polygram SIL G/UV 254 plate | Macherey-Nagel | 805021 | 64Cu production |
| Ion exchange column | BioRad | AG1-X8 | 64Cu production |
| Solid state target system for PETtrace | WKL | costum made | 64Cu production |
| 64Cu work-up module | WKL | costum made | 64Cu production |
| Dose calibrator | Capintec | CRC-25R | |
| PETtrace cyclotron | General Electric Medical Systems | ||
| DOTA-NHS | Macrocyclics | B-280 | DOTA-conjugation |
| Anti-cOVA-TCR antibody (KJ1-26) | Isolated from hybridoma cell culture | DOTA-conjugation | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | 71633 | DOTA-conjugation |
| H+ Chelex 100 | Sigma-Aldrich | C7901 | DOTA-conjugation |
| Amicon Ultra-15 filter unit | Merck Millipore | UFC910008 | DOTA-conjugation |
| Rotipuran ultrapure water | Carl Roth | HN68.3 | DOTA-conjugation |
| Ammonium acetate | Sigma-Aldrich | 32301 | DOTA-conjugation |
| PBS | University Tuebingen | DOTA-conjugation | |
| Micro Bio-spin P-6 column | Bio-Rad Laboratories | 7326221 | DOTA-conjugation |
| Sodium citrate | Sigma-Aldrich | 71497 | DOTA-conjugation |
| Cyclone Plus PhosphorImager | Perkin-Elmer | L2250116 | DOTA-conjugation |
| DMEM | Merck Millipore | 102568 | ingredient for T cell medium |
| FCS | Merck Millipore | S0115/1004B | ingredient for T cell medium |
| Sodium pyruvate | Merck Millipore | L0473 | ingredient for T cell medium |
| MEM-amino acids | Merck Millipore | K0293 | ingredient for T cell medium |
| HEPES | Merck Millipore | L 1613 | ingredient for T cell medium |
| Penicillin/Streptomycin | Merck Millipore | A2212 | ingredient for T cell medium |
| 0.05 mM 2-β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | ingredient for T cell medium |
| DO11.10 mice | in-house breeding | TH1 cell culture | |
| DPBS | Gibco | 14190144 | TH1 cell culture |
| Cell strainer 40 µm | Corning | 352340 | TH1 cell culture |
| ACK Lysing Buffer | Lonza | 10-548E | TH1 cell culture |
| CD4 MicroBeads, mouse | Miltenyi Biotech | 130-097-145 | TH1 cell culture |
| QuadroMACS separator | Miltenyi Biotech | 130-090-976 | TH1 cell culture |
| LS column | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | TH1 cell culture |
| anti-CD4 antibody (Gk1.5) | Isolated from hybridoma cell culture | TH1 cell culture | |
| anti-CD8 antibody (5367.2) | Isolated from hybridoma cell culture | TH1 cell culture | |
| Anti-rat antibody (MAR18.5) | Isolated from hybridoma cell culture | TH1 cell culture | |
| Rabbit complement MA | tebu-Bio | CL3221 | TH1 cell culture |
| Anti-IL-4 antibody (11B11) | Isolated from hybridoma cell culture | TH1 cell culture | |
| cOVA 323-339-peptide | EMC-micro-collections | Custom order | TH1 cell culture |
| CPG1668-oligonucleotides | Eurofins MWG Operon | Custom order | TH1 cell culture |
| IL-2 | Novartis | 65483-116-07 | TH1 cell culture |
| 96-well plates | Greiner | 655180 | TH1 cell culture |
| 24-well plates | Greiner | 662160 | TH1 cell culture |
| cell culture flask | Greiner | 660175 | TH1 cell culture |
| 48-well plates | Greiner | 677 180 | cell labeling |
| Gammacell 1000 | Best Theratronics | via inquiry | |
| Gulmay RT225 | Gulmay | via inquiry | |
| Trypan blue | Merck Millipore | L6323 | in vitro evaluation |
| Mouse IFN-γ ELISA | BD Biosciences | 558258 | in vitro evaluation |
| PE Annexin V Apoptosis Detection Kit | BD Biosciences | 559763 | in vitro evaluation |
| Tube 5 ml | Sarstedt | 55.476 | in vitro evaluation |
| Round-bottom tubes | BD Biosciences | 352008 | in vitro evaluation |
| Wizard γ-counter | Perkin-Elmer | 2480-0010 | in vitro evaluation |
| ELISA Reader MultiscanEX | Thermo Fisher Scientific | 51118177 | in vitro evaluation |
| Microscope | Leica | via inquiry | in vitro evaluation |
| BD LSRII | BD Biosciences | via inquiry | in vitro evaluation |
| BALB/c mice | Charles River | 028 | in vivo cell trafficking |
| Aluminum gel | Serva Electrophoresis | 12261.01 | in vivo cell trafficking |
| Xylazine | Bayer HealthCare | Ordered via University hospital | in vivo cell trafficking |
| Ketamine | Ratiopharm | Ordered via University hospital | in vivo cell trafficking |
| Isoflurane | CP-Pharma | Ordered via University hospital | in vivo cell trafficking |
| 30G needle | BD Biosciences | 304000 | in vivo cell trafficking |
| Syringe | BD Biosciences | 11612491 | in vivo cell trafficking |
| Capillaries 10 µl | VWR | 612-2439 | |
| Inveon PET scanner | Siemens Healthineers | no longer available | in vivo cell trafficking, alternative companies: Bruker, Mediso |
| Inveon SPECT/CT scanner | Siemens Healthineers | no longer available | in vivo cell trafficking |
| Inveon Research Workplace | Siemens Healthineers | image analysis, alternative software: Pmod |
References
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