Murino Linfócitos Rotulagem por⁶⁴ Cu-Antibody Receptor Segmentação para<em> In Vivo</em> Tráfico celular por PET / CT

Summary

Seguindo a preparação de um anticorpo monoclonal ⁶⁴ Cu-modificados se ligar a um receptor de células T de murino transgico, as células T são radiomarcados in vivo, analisadas para a viabilidade, funcionalidade, estabilidade rotulagem e apoptose, e transferidas adoptivamente para ratinhos com uma via aérea hipersensibilidade de tipo retardado reacção para imagem não invasivo por tomografia de emissão de positrões / tomografia computadorizada (PET / CT).

Abstract

Este protocolo ilustra a produção de ⁶⁴ Cu e o quelante de conjugao / radiomarcação de um anticorpo monoclonal (mAb), seguido por cultura de células de linfócitos de murídeo e o receptor ⁶⁴ de Cu-anticorpo segmentação das células. Avaliação in vitro do marcador radioactivo e não-invasivo de rastreamento de células in vivo num modelo animal de uma via respiratória de tipo retardado de reacção de hipersensibilidade (DTHR) por PET / CT são descritos.

Em detalhe, a conjugação de um mAb com o quelante de ácido 1,4,7,10-tetra-azaciclododecano-1,4,7,10-tetra-acético (DOTA) é mostrado. Após a produção de ⁶⁴ Cu radioactivos, marcação radioactiva do mAb DOTA-conjugado é descrito. Em seguida, a expansão de ovalbumina de galinha (Cova) CD4 ⁺ espec�ico interferão (IFN) -γ produtoras de células T auxiliares (Cova-TH1) e a radiomarcação subsequente das células Cova-TH1 estão representados. Várias técnicas in vitro são apresentados para avaliar a effects de ⁶⁴ Cu-radiomarcao sobre as células, tais como a determinação da viabilidade das células por exclusão do azul de tripano, a coloração para a apoptose com anexina V por citometria de fluxo, e a avaliação da funcionalidade por ensaio imunossorvente ligado a enzima de IFN-γ (ELISA) . Além disso, a determinação da incorporação radioactiva nas células e a estabilidade de marcação são descritos em detalhe. Este protocolo descreve ainda como realizar os estudos de seguimento de células em um modelo animal para uma DTHR das vias respiratórias e, por conseguinte, a indução de-induzida das vias respiratórias Cova DHTR aguda em ratinhos BALB / c está incluído. Finalmente, um fluxo de trabalho / CT robusta PET incluindo aquisição de imagem, reconstrução e análise é apresentada.

A abordagem de direccionamento do receptor ⁶⁴ de Cu-anticorpo com a internalização do receptor subsequente proporciona uma elevada especificidade e estabilidade, reduzida toxicidade celular, e as taxas de efluxo baixos em comparação com PET-traçadores comuns para marcação celular, por exemplo, ⁶⁴ Cu-pyruvaldehyde bis (N-4-metiltio-semicarbazona) ⁽⁶⁴ Cu-PTSM). Finalmente, a nossa abordagem permite não invasiva no rastreamento de células in vivo por PET / CT com uma óptima relação sinal-para-fundo durante 48 h. Esta abordagem experimental pode ser transferido para modelos animais e tipos de células diferentes com receptores ligados a membranas que são internalizados.

Introduction

Rastreamento de células não-invasiva é um instrumento versátil para monitorizar a função celular, migração e homing in vivo. Estudos recentes de rastreamento de células têm-se centrado no mesenquimais ^{1, 2} ou da medula óssea derivadas de células estaminais ³ no contexto da medicina regenerativa, as células brancas do sangue perifico autogos em inflamação ou linfócitos T em terapias de células adoptivas contra cancro de ^{3, 4.} A elucidação dos locais de acção e os princípios subjacentes biológicos de terapias à base de células é de grande importância. Linfócitos T citotóxicos CD8 ^+, por engenharia genética do receptor de antigénio quimérico (CAR) células T ou linfócitos que se infiltram no tumor (TIL) foram amplamente considerada como o padrão de ouro. No entanto, as células TH1 específicas para o antigénio associado a tumores provaram ser uma alternativa eficaz opção de tratamento ^{4, <}/ sup> ^{5, 6, 7.}

Como actores-chave na inflamação, as doenças auto-imunes específicas de órgãos (por exemplo, artrite reumatóide ou asma brônquica), e células de elevado interesse em imunoterapia do cancro, é importante caracterizar a distribuição e homing padrões temporais de células TH1. Não invasiva in vivo de imagiologia por PET apresenta, um método altamente sensível quantitativa ⁸ para analisar os padrões de migração celular, no retorno in vivo, e os sítios de acção de células T e respostas durante a inflamao, alergias, infecções ou de rejeição de tumor ^{9, 10, 11.}

Clinicamente, ^111In-oxina é usado para cintigrafia de leucócitos para a discriminação de inflamação e infecção ^{de 12,} enquanto que 2-desoxi-2- ⁽¹⁸F) fluoro-D-glucose ^(18F-FDG) é comumente utilizada para estudos de rastreio celular por PET ^{3, 13.} Uma grande desvantagem deste marcador de PET, no entanto, é a meia-vida curta do radionuclídeo ¹⁸ M em 109,7 min e a baixa estabilidade intracelular que impede a imagiologia em pontos de tempo mais tardios após a transferência adoptiva de células. Para longo prazo, os estudos in vivo de rastreio celular por PET, embora instável nas células, ⁶⁴ Cu-PTSM é frequentemente usado para marcar as células não especificamente ^{14, 15,} com efeitos prejudiciais minimizadas sobre a viabilidade das células T e a função ^{de 16.}

Este protocolo descreve um método para reduzir ainda mais os efeitos desvantajosos sobre a viabilidade e função das células utilizando um receptor de células T (TCR) de mAb marcado radioactivamente espec�ico. Em primeiro lugar, a produção do radioisótopo ⁶⁴ Cu, a conjugação do mAb KJ1-26 com the quelante DOTA, e o subsequente ⁶⁴ de Cu-radiomarcação são mostrados. Num segundo passo, o isolamento e a expansão de células TH1 Cova-de ratinhos dadores DO11.10 e a radiomarcação com ^{64Cu-carregado} DOTA-conjugado mAb KJ1-26 ⁽⁶⁴ Cu-DOTA-KJ1-26) são descritos em detalhe. A avaliação dos valores de absorção e de efluxo de radioactividade com um calibrador de doses e pela y-contagem, respectivamente, bem como a avaliação dos efeitos de ⁶⁴ Cu-radiomarcao sobre a viabilidade celular por exclusão com azul de tripano e funcionalidade com ELISA y IFN-são apresentados . Para não invasiva no rastreamento de células in vivo, o desencadeamento de um modelo de ratinho de-induzida aguda das vias aéreas Cova DTHR e aquisição de imagem por PET / CT após transferência adoptiva de células encontram-se descritos.

Além disso, esta abordagem de marcao podem ser transferidos para diferentes modelos de doença, as células T de murídeo com diferentes TCRs ou células gerais de interesse com receptores ligados a membranas ou mar expressãokers subjacente membrana contínua de vaivém ^17.

Protocol

Medidas de Segurança: Ao manusear radioactividade, armazenar 64 Cu atrás tijolos de chumbo 2 polegadas de espessura e utilizar respectivo blindagem para todos os vasos que transportam actividade. Use ferramentas apropriadas para tratar indiretamente fontes não blindados para evitar contato manual direto e minimizar a exposição a material radioativo. Sempre use radiação emblemas monitoramento dosimetria e equipamentos de proteção individual e verificar-se ea área de trabalho para a contaminação de …

Representative Results

A Figura 1 resume a marcação das células Cova-TH1 com o 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb e a concepção experimental para o in vitro e em estudos in vivo abrangidos neste protocolo. Figura 1: 64 de Cu-DOTA-KJ1-26-mAb processo de etiquetagem & Desenho Experimental. (A)</…

Discussion

Este protocolo apresenta um método de confiança e fácil de radiomarcar estavelmente células para o rastreamento in vivo por PET. Utilizando este método, as células Cova-TH1, isoladas e expandidas in vitro a partir de ratinhos dadores, poderia ser marcado radioactivamente com ⁶⁴ Cu-DOTA-KJ1-26-mAb e sua homing foi rastreado para o LNS pulmonares e perithymic como locais de apresentação em um Cova Cova-induzida DTHR aguda das vias aéreas.

A modificação d…

Materials

HCl, Suprapur	Merck, Darmstadt, Germany	1.00318	64Cu production
Methanol, Suprapur	Merck, Darmstadt, Germany	1.06007	64Cu production
Isopropanol, Suprapur	Merck, Darmstadt, Germany	1.0104	64Cu production
Pt/Ir (90/10) plate	Ögussa	Custom made	64Cu production
PEEK chamber	Ögussa	Custom made	64Cu production
64Ni	Chemotrade		64Cu production
Polygram SIL G/UV 254 plate	Macherey-Nagel	805021	64Cu production
Ion exchange column	BioRad	AG1-X8	64Cu production
Solid state target system for PETtrace	WKL	costum made	64Cu production
64Cu work-up module	WKL	costum made	64Cu production
Dose calibrator	Capintec	CRC-25R
PETtrace cyclotron	General Electric Medical Systems
DOTA-NHS	Macrocyclics	B-280	DOTA-conjugation
Anti-cOVA-TCR antibody (KJ1-26)		Isolated from hybridoma cell culture	DOTA-conjugation
Na2HPO4	Sigma-Aldrich	71633	DOTA-conjugation
H+ Chelex 100	Sigma-Aldrich	C7901	DOTA-conjugation
Amicon Ultra-15 filter unit	Merck Millipore	UFC910008	DOTA-conjugation
Rotipuran ultrapure water	Carl Roth	HN68.3	DOTA-conjugation
Ammonium acetate	Sigma-Aldrich	32301	DOTA-conjugation
PBS	University Tuebingen		DOTA-conjugation
Micro Bio-spin P-6 column	Bio-Rad Laboratories	7326221	DOTA-conjugation
Sodium citrate	Sigma-Aldrich	71497	DOTA-conjugation
Cyclone Plus PhosphorImager	Perkin-Elmer	L2250116	DOTA-conjugation
DMEM	Merck Millipore	102568	ingredient for T cell medium
FCS	Merck Millipore	S0115/1004B	ingredient for T cell medium
Sodium pyruvate	Merck Millipore	L0473	ingredient for T cell medium
MEM-amino acids	Merck Millipore	K0293	ingredient for T cell medium
HEPES	Merck Millipore	L 1613	ingredient for T cell medium
Penicillin/Streptomycin	Merck Millipore	A2212	ingredient for T cell medium
0.05 mM 2-β-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M3148	ingredient for T cell medium
DO11.10 mice		in-house breeding	TH1 cell culture
DPBS	Gibco	14190144	TH1 cell culture
Cell strainer 40 µm	Corning	352340	TH1 cell culture
ACK Lysing Buffer	Lonza	10-548E	TH1 cell culture
CD4 MicroBeads, mouse	Miltenyi Biotech	130-097-145	TH1 cell culture
QuadroMACS separator	Miltenyi Biotech	130-090-976	TH1 cell culture
LS column	Miltenyi Biotech	130-042-401	TH1 cell culture
anti-CD4 antibody (Gk1.5)		Isolated from hybridoma cell culture	TH1 cell culture
anti-CD8 antibody (5367.2)		Isolated from hybridoma cell culture	TH1 cell culture
Anti-rat antibody (MAR18.5)		Isolated from hybridoma cell culture	TH1 cell culture
Rabbit complement MA	tebu-Bio	CL3221	TH1 cell culture
Anti-IL-4 antibody (11B11)		Isolated from hybridoma cell culture	TH1 cell culture
cOVA 323-339-peptide	EMC-micro-collections	Custom order	TH1 cell culture
CPG1668-oligonucleotides	Eurofins MWG Operon	Custom order	TH1 cell culture
IL-2	Novartis	65483-116-07	TH1 cell culture
96-well plates	Greiner	655180	TH1 cell culture
24-well plates	Greiner	662160	TH1 cell culture
cell culture flask	Greiner	660175	TH1 cell culture
48-well plates	Greiner	677 180	cell labeling
Gammacell 1000	Best Theratronics	via inquiry
Gulmay RT225	Gulmay	via inquiry
Trypan blue	Merck Millipore	L6323	in vitro evaluation
Mouse IFN-γ ELISA	BD Biosciences	558258	in vitro evaluation
PE Annexin V Apoptosis Detection Kit	BD Biosciences	559763	in vitro evaluation
Tube 5 ml	Sarstedt	55.476	in vitro evaluation
Round-bottom tubes	BD Biosciences	352008	in vitro evaluation
Wizard γ-counter	Perkin-Elmer	2480-0010	in vitro evaluation
ELISA Reader MultiscanEX	Thermo Fisher Scientific	51118177	in vitro evaluation
Microscope	Leica	via inquiry	in vitro evaluation
BD LSRII	BD Biosciences	via inquiry	in vitro evaluation
BALB/c mice	Charles River	028	in vivo cell trafficking
Aluminum gel	Serva Electrophoresis	12261.01	in vivo cell trafficking
Xylazine	Bayer HealthCare	Ordered via University hospital	in vivo cell trafficking
Ketamine	Ratiopharm	Ordered via University hospital	in vivo cell trafficking
Isoflurane	CP-Pharma	Ordered via University hospital	in vivo cell trafficking
30G needle	BD Biosciences	304000	in vivo cell trafficking
Syringe	BD Biosciences	11612491	in vivo cell trafficking
Capillaries 10 µl	VWR	612-2439
Inveon PET scanner	Siemens Healthineers	no longer available	in vivo cell trafficking, alternative companies: Bruker, Mediso
Inveon SPECT/CT scanner	Siemens Healthineers	no longer available	in vivo cell trafficking
Inveon Research Workplace	Siemens Healthineers		image analysis, alternative software: Pmod