Utveckling av<em> Metarhizium anisopliae</em> Som en mykosinsekticid: från isolering till fältprestanda
Summary
Här redovisar vi de olika faser som är inblandade i den kunskapsbaserade utvecklingen av en effektiv mycoinsekticid, inklusive isolering, identifiering, screening och urval av "entomopathogenic fungus " best fit ", Metarhizium anisopliae , för bekämpning av skadegörare i jordbruket .
Abstract
Ett stort problem vid utvecklingen av kommersiella mycoinsekticider är dödhastigheten jämfört med den för kemiska insekticider. Därför är isolering och screening för valet av en snabbverkande, mycket virulent entomopatogen svamp viktiga steg. Entomopatogena svampar, som Metarhizium, Beauveria och Nomurea , som verkar genom kontakt, passar bättre än Bacillus thuringiensis eller nukleopolyhedrosvirus (NPV), som måste intas av insekterna. I det nuvarande arbetet isolerade vi 68 Metarhizium- stammar från infekterade insekter med hjälp av en jordutspädning och betesmetod. Isolaten identifierades genom amplifiering och sekvensering av ITS1-5.8S-ITS2- och 26S-rDNA-regionen. Den mest virulenta stammen av Metarhizium anisopliae valdes utifrån median dödlig koncentration (LC 50 ) och tid (LT 50 ) erhållen vid insekts bioassays mot III-instarlarver från Helicoverpa armigera.Massproduktionen av sporer av den valda stammen utfördes med fermentering med fast tillstånd (SSF) med användning av ris som ett substrat i 14 dagar. Sporer extraherades från den sporulerade biomassen med användning av 0,1% tween-80, och olika formuleringar av sporerna framställdes. Fältförsök av formuleringarna för kontroll av en H. armigera- infestation i duvaärter utfördes genom randomiserad blockdesign. Infestationskontrollnivåerna erhållna med olja och vattenhaltiga formuleringar (78,0% respektive 70,9%) var bättre än 63,4% erhållna med kemisk bekämpningsmedel.
Introduction
Från införandet av organiska klorpesticider i 1940-talet i Indien har användningen av bekämpningsmedel ökat många gånger 1 , med skadedjur som fortfarande har kostat miljarder rupier 2 årligen när det gäller avkastningsminskning i jordbruksproduktionen. Den utbredda och oskäliga användningen av syntetiska bekämpningsmedel är ett kontinuerligt hot mot miljön och människors hälsa 1 . Den oskäliga användningen av bekämpningsmedel leder till rester i jorden och utarmning av naturliga skadedjur. Det tjänar också som ett kraftigt urvalstryck för att förändra den genetiska sminken av en skadedjurspopulation, vilket leder till utvecklingen av resistans 1 . Trots de enorma fördelarna med den gröna revolutionen, som krävde höga insatser, som gödselmedel och bekämpningsmedel, fortsätter skadedjur att vara en stor biotisk begränsning. En generell uppskattning av registrerade årliga växtförluster i Indien och i världen är USD 12 miljarderEf "> 2 respektive USD 2.000 miljarder 3 respektive.
När kemiska bekämpningsmedel har skadliga effekter när de används för att bekämpa skadedjur, är det viktigt att söka efter alternativa metoder som är ekologiskt sunda, tillförlitliga, ekonomiska och hållbara. Biologisk kontroll erbjuder ett lämpligt alternativ och inkluderar användning av parasiter, rovdjur och mikrobiella patogener 4 . Svampar är till exempel kända för att infektera ett brett spektrum av insekter skadedjur, inklusive lepidopteraner, hymenopteraner, coleopteraner och dipteraner, vilket ofta resulterar i naturliga epizootier. I motsats till andra bakteriella och virala insektsbekämpningsmedel är dessutom verkningsmekanismen hos insektspatogena svampar genom kontakt 5 . Dessa svampar innefattar en heterogen grupp av över 100 genera, med cirka 750 arter rapporterade bland olika insekter. De viktiga svamppatogenerna är: Metarhizium sp., Beauveria sP., Nomuraea rileyi , Lecanicillium lecanii och Hirsutella sp., För att nämna några 6 . M. anisopliae (Metchnikoff) Sorokin är den näst mest använda entomopatogena svampen vid biokontroll. Det är känt att attackera över 200 arter av insekter 7 .
I denna studie presenteras olika steg som är involverade i den kunskapsbaserade utvecklingen av en mykoprotid med användning av M. anisopliae . Detta innefattar: 1) identifiering av en källa ( dvs mark eller mycosed insekter) för virulenta entomopatogener, 2) entomopatogen identifiering och urval, 3) strategier för att upprätthålla sin virulenta natur och effektivitet i laboratorie bioanalys och inom området, 4 ) Den kostnadseffektiva formuleringen av infektiva propaguler, 5) utvecklingen av unika kvalitetskontrollparametrar för virulent preparering, och 6) bioprospektering och värdetillsats.
Protocol
Representative Results
Discussion
Under 1880-talet gjordes det första försöket att använda Metarhizium för att styra scarabafeln, Anisoplia austriaca och sockerbetorskurculio, Cleonis punctiventris 21 . I detta protokoll var en av förutsättningarna att isolera en virulent stam, antingen från jorden eller från smittade insekter. Faktum är att andra parametrar, såsom LC 50 , LT 50 och ST 50 , väsentligt bidrog till kostnadseffektiviteten hos produkten <su…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna erkänner bidrag från samarbetspartnerna från det biotekniska institutets indo-schweiziska samarbete i bioteknik (ISCB), Institutionen för bioteknik, New Delhi och det schweiziska byrån för utveckling och samarbete, Bern, Schweiz. Bidrag från projektstuderande och personal som deltar i utvecklingen av mycoinsekticiden, inklusive Vandana Ghormade, Pallavi Nahar, Priya Yadav, Shuklangi Kulkarni, Manisha Kapoor, Santosh Chavan, Ravindra Vidhate, Shamala Mane och Abhijeet Lande, erkänns. EKP och SGT tackar universitetsbidragskommissionen, Indien och rådet för vetenskaplig och industriell forskning (CSIR), Indien, respektive för forsknings stipendier. MVD erkänner stödet från rådet för industriell och vetenskaplig forskning, New Delhi för Emeritus Scientist Scheme. Författarna är tacksamma för Institutionen för bioteknik, New Delhi, Indien för det ekonomiska stödet enligt ISCB och SBIRI-programmen. Vi är tacksammaGranskare för deras ingångar.
Materials
| Agar | Hi-Media | RM666 | Reagent |
| Ammonium sulphate | Thomas Baker | 11645 | Reagent |
| DNA analyzer | Applied biosystem | ABI prism 3730 | Instrument |
| DNA islation kit | Qiagen | 69104 | Reagent |
| Dodine | Sigma | 45466 | Reagent |
| Gel extraction kit | Qiagen | 28604 | Reagent |
| Glucose | Hi-Media | GRM077 | Reagent |
| Knapsac sparyer | Kaypee | HY-16L (1004) | Instrument |
| Peptone | Hi-Media | RM006-500G | Reagent |
| Polypropylene vials | Laxbro | SV-50 | Plasticware |
| Potato dextrose agar (PDA) | Hi-Media | M096-500G | Reagent |
| Tween-80 | SRL | 28940 | Reagent |
| Ultra low volume sparyer | Matabi | INSECDISK | Instrument |
| Unicorn-bags | Unicorn | UP-140024-SMB | Autoclavalbe bag for SSF |
| Yeast extract | Hi-Media | RM027-500G | Reagent |
| Chromas 2.1 | software |
References
- Aktar, M. W., Sengupta, D., Chowdhury, A. Impact of pesticides use in agriculture: their benefits and hazards. Interdisciplinary Toxicology. 2 (1), 1-12 (2009).
- Dhaliwal, G. S., Jindal, V., Mohindru, B. Crop losses due to insect pests: Global and Indian scenario. Indian J Entomol. 77 (2), 165-168 (2015).
- Popp, J., Peto, K., Nagy, J. Pesticide productivity and food security. A review. Agronomy for Sustainable Development. 33 (1), 243-255 (2015).
- van Lenteren, J. C., Manzaroli, G., Albajes, R., Gullino, M. L., van Lenteren, J. C., Elad, Y. Evaluation and use of predators and parasitoids for biological control of pests in greenhouses. Integrated pest and disease management in greenhouse crops. , 183-201 (1999).
- Charnley, A. K., Collins, S. A., Kubicek, C. P., Druzhinina, I. S. Entomopathogenic fungi and their role in pest control. The Mycota IV: Environmental and Microbial Relationships. , 159-187 (2007).
- Deshpande, M. V., MV, D. e. s. h. p. a. n. d. e., et al. Comparative evaluation of indigenous fungal isolates, Metarhizium anisopliae M34412, Beauveria bassiana B3301 and Nomuraea rileyi N812 for the control of Helicoverpa armigera (Hüb.) on pulses. Proceeding of the international workshop on entomopathogenic fungi – a valuable alternative to fight against insect pests. , 51-59 (2004).
- Roberts, D. W., Hajek, A. E., Leathan, G. F. Entomopathogenic fungi as bioinsecticides. Frontiers in industrial mycology. , 144-159 (1992).
- Goettel, M., Inglis, G. D., Lacey, L. A. . Fungi: Hyphomycetes. Manual of techniques in insect pathology. , 213-245 (1996).
- Keller, S., Kessler, P., Schweizer, C. Distribution of insect pathogenic soil fungi in Switzerland with special reference to Beauveria brongniartii and Metharhizium anisopliae. BioControl. 48 (3), 307-319 (2003).
- White, T. J., Bruns, T., Lee, S., Taylor, J., Innis, M. A. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. PCR-Protocols: A guide to methods and applications. , 315-322 (1990).
- Ignoffo, C. M., Futtler, B., Marston, N. L., Hostetter, D. L., Dickerson, W. A. Seasonal incidence of the entomopathogenic fungus Spicaria rileyi associated with noctuid pests of soybeans. J Invertebr Pathol. 25 (1), 135-137 (1975).
- Abbott, W. S. A method for computing the effectiveness of an insecticide. J Econ Entomol. 18 (2), 265-267 (1925).
- Nahar, P. . Development of biocontrol agents for the control of pests in agriculture using chitin metabolism as target. , 137 (2004).
- Kulkarni, S. A., et al. Comparison of Metarhizium isolates for biocontrol of Helicoverpa armigera (Lepidoptera: Noctuidae) in chickpea. Biocontrol Sci Tech. 18 (8), 809-828 (2008).
- Jeffs, L. B., Khachatourians, G. G. Estimation of spore hydrophobicity for members of the genera Beauveria, Metarhizium, and Tolypocladium by salt-mediated aggregation and sedimentation. Can J Microbiol. 43 (1), 23-28 (1997).
- Henderson, C. F., Tilton, E. W. Tests with acaricides against the brow wheat mite. J Econ Entomol. 48 (2), 157-161 (1955).
- Hassani, M. . Development and proving of biocontrol methods based on Bacillus thuringiensis and entamopathogenic fungi against the cotton pests Spodoptera littoralis, Helicoverpa armigera (Lepidoptera: Noctuidae) and Aphis gossypii (Homoptera: Aphididae). , (2000).
- Enkerli, J., Ghormade, V., Oulevey, C., Widmer, F. PCR-RFLP analysis of chitinase genes enable efficient genotyping of Metarhizium anisopliae var. anisopliae. J Invert Pathol. 102 (2), 185-188 (2009).
- Bidochka, M. J., Melzer, M. J. Genetic polymorphism in three subtilisin-like protease isoforms (Pr1A, Pr1B and Pr1C) from Metarhizium strains. Can. J. Microbiol. 46 (12), 1138-1144 (2000).
- McCoy, C. W., Samson, R. A., Boucias, D. G., Ignoffo, C. M., Mandava, N. B. Entomogenous fungi. Handbook of natural pesticides, Microbial insecticides, Part A. Entomogenous protozoa and fungi. , 151-236 (1988).
- Nahar, P. B., et al. Effect of repeated in vitro sub-culturing on the virulence of Metarhizium anisopliae against Helicoverpa armigera (Lepidoptera Noctuidae). Biocontrol Sci Tech. 18 (4), 337-355 (2008).
- Kapoor, M., Deshpande, M. V. Development of mycoinsecticide for the control of insect pests: Issues and challenges in transfer of technology from laboratory to field. Kavaka. 40, 45-56 (2013).
- Deshpande, M. V. Mycopesticide Production by Fermentation: Potential and Challenges. Crit Rev Microbiol. 25 (3), 229-243 (1999).
