Un sistema di coltura 3D Rapid Cartuccia filtro-based per la prostata primaria cellulare Differenziazione
Summary
Here, we present a method for the establishment of a rapid in vitro system that supports the three dimensional culturing and subsequent luminal differentiation of primary prostate epithelial cells.
Abstract
le cellule riprogrammate condizionale (CRC) forniscono un metodo sostenibile per la coltura di cellule primarie e la capacità di sviluppare ampie "biobanche di vita" di pazienti derivate linee cellulari. Per molti tipi di cellule epiteliali, vari approcci tridimensionale (3D) di coltura sono stati descritti che supporta uno stato differenziato migliorata. Mentre CRC mantengono la loro lineage committment al tessuto dal quale sono isolati, non riescono ad esprimere molti dei marcatori di differenziazione associate al tessuto di origine quando coltivate in normali due condizioni dimensionali (2D) di coltura. Per migliorare l'applicazione della CRC paziente-derivato per la ricerca sul cancro alla prostata, un formato di cultura 3D è stato definito che consente una rapida luminale differenziazione cellulare (2 settimane in totale) in entrambe le cellule epiteliali della prostata normali e tumorali di derivazione. Qui, un formato basato su inserto del filtro è descritto per la coltura e differenziazione di entrambe le normali e maligni CRC prostata. A deDescrizione coda delle procedure richieste per la raccolta delle cellule e di elaborazione per la colorazione immunoistochimica e immunofluorescenza sono forniti. Collettivamente formato coltura 3D descritto, in combinazione con le linee CRC primari, fornisce un importante medio per evidenziare sistema modello produttività per la ricerca della prostata biospecimen-based.
Introduction
L'identificazione e l'uso di terapie del cancro che sono personalizzati per gli individui sono un obiettivo primario nella ricerca sul cancro. Recentemente, sono stati sviluppati nuovi approcci che consentono una maggiore facilità nella creazione di colture cellulari primarie, fornendo potenzialmente modi sia di identificare e testare terapie personalizzate. Ad esempio, la prostata basata R-spondina approccio organoide 1 consente tridimensionale (3D) coltura di normali e metastatici cellule tumorali della prostata in una matrice extracellulare commerciale (ad esempio, Matrigel), mentre il metodo condizionale riprogrammazione delle cellule (CRC) sviluppato presso Georgetown 2, 3 utilizza più condizioni di coltura 2D standard. In particolare, la combinazione di un inibitore della chinasi Rho (Y-27632) e cellule feeder fibroblasti murini J2 irradiati portano alla coltura indefinito di CRC cheratinociti 2. La metodologia è CRCestremamente robusto, con linee cellulari primarie stabilite con successo e mantenuto a tempo indeterminato dalla prostata e molti altri tessuti epiteliali normali e maligne 3. È importante sottolineare che la nostra tecnologia CRC ha permesso la rapida identificazione della base eziologico per papillomatosi respiratoria ricorrente in un paziente che non era riuscito un certo numero di trattamenti farmacologici precedenti. Inoltre, utilizzando normali e tumorali derivate dal CRC, l'identificazione di successo di un farmaco approvato dalla FDA, vorinostat, è stata fatta entro due settimane dalla biopsia dei tessuti iniziale. Il paziente è stato posto sulla vorinostat, conseguente trattamento di successo della loro malattia 4.
La prostata normale si compone di luminale, basale e le cellule neuroendocrine rari 5. cellule luminali formano lo strato epiteliale colonnare della ghiandola ed esprimono il recettore degli androgeni (AR), così come altri marcatori luminali quali citocheratine 8 e 18 e proantigene specifico-stato (PSA) 6. Viceversa, le cellule basali sono localizzati sotto lo strato luminale ed esprimono citocheratina 5 e p63, ma bassi livelli di AR 5. Abbiamo 7, 8, 9 e altri 10 hanno utilizzato con successo CRC prostata in preclinici indagini sensibilità ai farmaci meccanicistici. Tuttavia, se coltivate in condizioni di coltura tissutale 2D standard, queste cellule non riescono a cooperare pienamente AR segnalazione 10. È importante sottolineare che, quando posto sotto la capsula renale di topi immunodeficienti, il CRC riacquistato normale prostata architettura e la funzione ghiandolare che indica che CRC prostata mantengono il loro impegno lignaggio, quando sono immessi in un ambiente permissivo. Lo sviluppo del sistema di coltura cellulare basato inserto filtro qui descritto consente rapidi (2 settimane) differenziazione in vitro di CRC prostata come evidenziato by l'aumentata espressione di geni bersaglio AR e AR, nonché diminuzione dei livelli di p63.
Gli inserti del filtro utilizzati contengono membrane di policarbonato (dimensione dei pori, 0,4 micron) che possono sostenere la coltura di cellule di mammifero. Il sistema, sviluppato, fa uso di normali e maligne CRC prostata, piastre di coltura così 6 e gli inserti del filtro. Terreni di coltura cellulare condizionati dalle cellule J2 11 è posto nei media da camera e della prostata differenziazione di fondo nella camera superiore. Le tecniche descritte nel presente documento supportano la differenziazione delle cellule della prostata luminale entro una settimana 2 lasso di tempo, in linea con gli obiettivi della medicina personalizzata. Era inoltre indispensabile sviluppare le metodologie che consentono la profilatura molecolare, genetica e cellulare completa delle culture. Approcci per isolare DNA, RNA e proteine da cellule rilasciate dalla superficie del filtro sono stati sviluppati e semplificato per l'elaborazione del campione accurata ripetizione. Finally, la metodologia necessaria per la rimozione del filtro per consentire incorporamento, sezionamento e per H & E, immunoistochimica e immunofluorescenza colorazione, è completamente descritto.
Protocol
Representative Results
Discussion
linee cellulari primarie sono una piattaforma importante e in rapido sviluppo per la ricerca sul cancro. Il sistema di coltura 3D basato su inserto cultura sostiene la differenziazione della prostata CRC primari entro un lasso di tempo di due settimane. Il metodo del filtro CRC rappresenta un nuovo metodo di media produttività per la ricerca della prostata. Esistenti modelli del mouse PDX sono in termini di tempo ed estremamente costoso, e molti dei campioni PDX non possono essere coltivate in cultura, limitando la spe…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questa ricerca è stata sostenuta da T32 (CA 9686-18) e TL1 (TL1TR001431) premi post-dottorato borsa di formazione (LT), DOD PC140268 (CA), W81XWH-13-1-0327 (CA) TR000102-04 (CA), così come U01 PAR-12-095 (Kumar) e P30 CA051008-21 (Weiner). la fissazione del campione, sezionamento e colorazione è stata eseguita nel Lombardi Comprehensive Cancer Center e Istologia del tessuto Shared Resource. Ringraziamo Richard Schlegel per le discussioni utili. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del National Cancer Institute e il National Institutes of Health.
Materials
| Corning Costar Snapwell Culture Inserts | Corning | 3801 |
| Millicell Cell Culture Inserts | Millipore | PIHP01250 |
| Multiwell 6 Well | Falcon | 353046 |
| Gelatin 0.1% in water | Stemcell Technologies | 7903 |
| Sterile Saftey Scapel 10 Blade | Integra Miltex | 4-510 |
| Sterile Standard Scalpel 11 Blade | Integra Miltex | 4411 |
| RIPA Lysis and Extraction Buffer | Thermofisher Scientific | 89900 |
| Sodium Fluoride | Fishcer Scientific | S299-100 |
| Sodium Vanadate | Fishcer Scientific | 13721-39-6 |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 3483123 |
| Protease Inhibitor Cocktail (AEBSF, Aprotinin, Bestatin, E-64, Leupeptin and Pepstatin A) | Sigma-Aldrich | P8340 |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Thermofisher Scientific | 25200-056 |
| DMEM | Thermofisher Scientific | 11965-092 |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 |
| Glutamine | Thermofisher Scientific | 25030081 |
| Penicillin Streptomycin | Thermofisher Scientific | 15140-122 |
| F-12 Nutrient Mix Media | Thermofisher Scientific | 11765054 |
| Y-27632 dihydrochloride Rock inhibitor | Enzo | ALX-270-333-M025 |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 |
| EGF | Thermofisher Scientific | PHG0315 |
| Insulin | Thermofisher Scientific | 12585-014 |
| Cholera Toxin | Sigma-Aldrich | C3012 |
| Gentamicin | Thermofisher Scientific | 15710-064 |
| Fungizone | Fisher Scientific | BP264550 |
| Trizol Reagent | Invitrogen | 15596026 |
| Histogel Specimen Processing Gel (hydroxyethyl agarose (HEA)) | Thermo Scientific | HG-4000-012 |
| Non-Adherent Dressing | Telfa | KDL2132Z |
| Cell Culture Dish | Sigma | SIAL0167 |
| HISTOSETTE II Tissue Processing / Embedding Cassettes | Crystalgen | CG-M492 |
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