Protocols described here allow for the study of the electrical properties of excitable cells in the most non-invasive physiological conditions by employing zebrafish embryos in an in vivo system together with a fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based genetically encoded voltage indicator (GEVI) selectively expressed in the cell type of interest.
The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the cells are located. Specifically, they have been developed to analyze the electrical activity of excitable cells, such as spinal neurons. In such a scenario, it is crucial to preserve the integrity of the spinal cell, but it is also important to preserve the anatomy and physiological shape of the systems involved. Indeed, the comprehension of the manner in which the nervous system-and other complex systems-works must be based on a systemic approach. For this reason, the live zebrafish embryo was chosen as a model system, and the spinal neuron membrane voltage changes were evaluated without interfering with the physiological conditions of the embryos.
Here, an approach combining the employment of zebrafish embryos with a FRET-based biosensor is described. Zebrafish embryos are characterized by a very simplified nervous system and are particularly suited for imaging applications thanks to their transparency, allowing for the employment of fluorescence-based voltage indicators at the plasma membrane during zebrafish development. The synergy between these two components makes it possible to analyze the electrical activity of the cells in intact living organisms, without perturbing the physiological state. Finally, this non-invasive approach can co-exist with other analyses (e.g., spontaneous movement recordings, as shown here).
विवो प्रणालीगत घटक विश्लेषण में वैज्ञानिकों को सेलुलर व्यवहार को सबसे विश्वसनीय तरीके से जांचना पड़ता है। यह विशेष रूप से सच है जब जांच के तहत गतिविधि तंत्रिका तंत्र में सेल-सेल (दोनों संपर्क- और गैर संपर्क-निर्भर) संपर्कों से प्रभावित होती है, जहां झिल्ली वोल्टेज उत्तेजनात्मक कोशिकाओं के बीच संचार को गति प्रदान करता है। इन विद्युत संकेतों द्वारा एन्कोड की गई जानकारी की समझ, तंत्रिका तंत्र दोनों शारीरिक और रोग दोनों राज्यों में काम करने के तरीके को समझने की कुंजी है।
अधिकांश गैर इनवेसिव शारीरिक परिस्थितियों में सेल विद्युत गुणों का अध्ययन करने के लिए, कई आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड वोल्टेज संकेतकों को हाल ही में 1 विकसित किया गया है। ऑप्टिकल वोल्टेज सेंसर की पिछली पीढ़ियों (मुख्य रूप से वोल्टेज-संवेदनशील डाईज) के विपरीत, जीईवीआई बरकरार तंत्रिका तंत्र के विवो विश्लेषण में अनुमति देते हैं, औरउनकी अभिव्यक्ति विशिष्ट सेल प्रकार या जनसंख्या के लिए सीमित हो सकती है
जीबिजिश भ्रूण GEVIs के लिए जिम्मेदार महान क्षमता का लाभ लेने के लिए पसंद के vivo "सब्सट्रेट" में है। वास्तव में, इसकी ऑप्टिकल स्पष्टता और इसके सरलीकृत अभी तक विकासशील संरक्षित तंत्रिका तंत्र के लिए धन्यवाद, zebrafish मॉडल नेटवर्क में हर सेलुलर घटक के सीधा पहचान और हेरफेर की अनुमति देता है। दरअसल, FRET- आधारित GEVI मत्स्यस्त्री 3 के रोजगार ने एमियोथ्रोफिक पार्श्व स्केलेरोसिस (एएलएस) 4 के एक ज़ेब्राफिश मॉडल में स्पाइनल मोटर न्यूरॉन व्यवहार में पूर्व-लक्षण-परिवर्तन की पहचान करने के लिए नेतृत्व किया।
विवो प्रोटोकॉल में निम्नलिखित वर्णित हैं कि कैसे न्यूरॉनल-विशिष्ट तरीके से मरमेड को व्यक्त करने वाले बरकरार zebrafish भ्रूण में रीढ़ की हड्डी के मोटर न्यूरॉन्स के विद्युत गुणों की निगरानी करना। इसके अलावा, यह दर्शाता है कि फार्माकोलॉजिकल रूप से प्रेरित चानऐसे विद्युत गुणों में जीई को भ्रुण स्वभाविक कॉयलिंग की आवृत्ति में बदलाव के साथ जोड़ा जा सकता है, स्टैरियोटाइपिक मोटर गतिविधि जो कि विकास के प्रारंभिक दौर में zebrafish के आंदोलन व्यवहार को दर्शाती है।
यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल ने हमें zebrafish भ्रूण रीढ़ की हड्डी मोटर न्यूरॉन्स और सहज coiling व्यवहार, सबसे प्रारंभिक स्टीरियोटाइपिक मोटर गतिविधि, जो भ्रूण के विकास के 17 एचपीएफ के आसपास दिखाई देता है और 24 एचपीएफ <sup …
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to thank Simona Rodighiero for her priceless support with the FRET imaging analysis.
Low Melting Point Agarose | Sigma-Aldrich | A9414 |
DMSO | Sigma-Aldrich | W387520 |
Riluzole | Sigma-Aldrich | R116 |
Pfu Ultra HQ DNA polymerase | Agilent Technologies – Stratagene Products Division | 600389 |
T3 Universal primer | Sigma-Aldrich | |
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up system | Promega | A9280 |
Universal SmaI primer | Eurofins | |
StrataClone Mammalian Expression Vector System / pCMV-SC blunt vector | Agilent Technologies – Stratagene Products Division | 240228 |
SmaI | New England Biolabs | R0141S |
T4 DNA ligase | Promega | M1801 |
SalI | New England Biolabs | R0138S |
EcoRV | New England Biolabs | R0195S |
35 mm, glass-bottomed imaging dish | Ibidi | 81151 |
forceps | Sigma-Aldrich | F6521 |
Stereomicroscope | Leica Microsystems | M10 F |
Digital camera | Leica Microsystems | DFC 310 FX |
Leica Application Suite 4.7.1 software | Leica Microsystems | |
QuickTime Player, v10.4 | Apple | |
Confocal microscope (inverted) | Leica Microsystems | TCS SP5 |
Microinjector | Eppendorf | Femtojet |
ImageJ macro Biosensor_FRET | ||
GraphPad Prism 6.0c | GraphPad Software, Inc |