باستخدام البيولوجيا الاصطناعية إلى المهندس الخلايا الحية تتفاعل مع المواد القابلة للبرمجة
Summary
تعرض هذه الورقة مجموعة من بروتوكولات لتطوير الخلايا المهندسة والسطوح functionalized التي تمكن المهندسة صناعي كولاي للسيطرة والتعامل مع أسطح المواد القابلة للبرمجة.
Abstract
لقد قمنا بتطوير واجهة غير الحيوية للالأحيائية التي تمكن خلايا هندسيا للسيطرة على خصائص المواد من سطح functionalized. ويتكون هذا النظام من خلال إنشاء وحدتين: سلالة هندسيا صناعيا من E. خلايا القولونية واجهة المواد functionalized. ضمن هذه الورقة، ونحن بالتفصيل بروتوكول للهندسة وراثيا السلوكيات المختارة ضمن سلالة كولاي باستخدام استراتيجيات الاستنساخ الجزيئي. وحالما يتم وضع هذه السلالة تنتج مستويات مرتفعة من البيوتين عند التعرض لمحفز كيميائي. بالإضافة إلى ذلك، فإننا بروتوكولات التفاصيل لخلق سطحين functionalized مختلفة، كل منها قادرة على الرد على البيوتين توليفها الخلية. معا، ونحن تقديم منهجية لخلق صلة، نظام اللاأحيائي للالأحيائية التي تسمح خلايا للسيطرة على تركيب المواد والتجمع على ركائز غير الحية هندسيا.
Introduction
هنا، ونحن التقرير الإجراءات لتطوير ركيزة للبرمجة قادرة على الاستجابة لإشارة كيميائية من خط خلية هندسيا. 1 ونحن نفعل ذلك من خلال خلق واجهة البيوتين streptavidin أن يستجيب لالبيوتين التي تنتجها المهندسة صناعي القولونية (إي كولاي) الخلايا. سابقا، وقد تم تصميم الأسطح القابلة للبرمجة لمجموعة واسعة من التطبيقات من الكشف عن السموم 2 ونقطة من الرعاية التشخيص 3 في الدفاع والأمن. 4 بينما الأسطح القابلة للبرمجة يمكن أن تكون مفيدة كما أجهزة الاستشعار والمحركات، فإنها يمكن أن تكون "أكثر ذكاء" من وهب لهم القدرة على التكيف مع التحديات البيئية المختلفة. في المقابل، حتى الكائنات الدقيقة بسيطة، مثل كولاي، لديها القدرة على التكيف الكامنة وقادرة على الاستجابة للتحديات مع حلول متطورة وغالبا غير متوقعة. وقد مكن هذا التكيف E.السكان القولونية، التي تسيطر عليها شبكات الجينات المعقدة، وإلى فعالية من حيث التكلفة البحث عن موارد، 5 خلق منتجات ذات قيمة مضافة، 6 وحتى السلطة الروبوتات الصغيرة الحجم. 7 بواسطة اقتران مزايا التكيف من الخلايا الحية مع استخدام الأسطح القابلة للبرمجة، ونحن يمكن أن تخلق ركيزة الذكية قادرة على الاستجابة للظروف البيئية المختلفة.
وقد أعطى البيولوجيا الاصطناعية الباحثين قدرات جديدة لبرمجة سلوك الكائنات الحية. عن طريق الهندسة خلايا لاحتواء شبكات تنظيمية الجين الجديد، يمكن للباحثين تصميم الخلايا التي تظهر مجموعة من السلوكيات المبرمجة. 8، 9 أبعد من البحوث الأساسية، ويمكن استخدام هذه السلوكيات لتطبيقات مثل السيطرة على تجميع المواد وإنتاج بيولوجيا المنتجات ذات القيمة المضافة. 10 وهنا، ونحن بالتفصيل كيف استخدمنا أدوات البيولوجيا الاصطناعية أونgineer على القولونية E. سلالة تؤلف البيوتين على الاستقراء. وقد تم تطوير هذه السلالة باستخدام أساليب انزيم التقييد استنساخ لتجميع البلازميد، pKE1-اسي-bioB. هذا البلازميد، عندما تتحول إلى E. القولونية سلالة K-12 MG1655، يمنح الخلايا مع القدرة على التعبير عن مستويات مرتفعة من bioB، وهو إنزيم أساسي لتخليق البيوتين. عندما الناجم عن الخلايا تحولت مع الآيزوبروبيل β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)، وقدمت مع مقدمة البيوتين، desthiobiotin (DTB)، أنتجت مستويات مرتفعة من البيوتين.
التفاعل البيوتين هي ملزمة مع streptavidin هي واحدة من أقوى الروابط غير التساهمية الموجودة في الطبيعة. على هذا النحو، والتفاعل البيوتين streptavidin على حد سواء، تتميز بشكل جيد وتوظيف للغاية في مجال التكنولوجيا الحيوية. 11 وفي هذه المخطوطة، نقدم استراتيجيتين توظيف التفاعل البيوتين streptavidin على الإحساس وكشف البيوتين تنتج الخلية مع سطح functionalized. نحنالرجوع إلى هذه السطوح المتناقضة كما خطط "غير المباشرة" و "مباشرة" السيطرة. في مخطط السيطرة غير المباشرة، والبيوتين المنتجة خلية تتنافس مع البيوتين الذي تم مترافق وثبتوا على سطح البوليسترين لstreptavidin مواقع الربط. بالإضافة إلى ذلك، مترافق في streptavidin مع البيروكسيديز الفجل (HRP). برنامج الصحة الإنجابية يعدل 3، 3، 5، 5'-tetramethylbenzidine (TMB)، لإنتاج إشارة ضوئية (12) الذي قد يخضع للمراقبة عن طريق قياس الامتصاصية الطيفية (أي الكثافة البصرية) في 450 نانومتر (OD 450). وهكذا، فإن مخطط السيطرة غير المباشرة يسمح للباحثين لقياس البيوتين تنتج الخلية من خلال رصد attentuation للإشارة OD 450.
مخطط السيطرة المباشرة يستغل الحدث streptavidin البيوتين عن طريق شل حركة streptavidin مباشرة إلى سطح المادة والسماح البيوتين تنتج الخلية وHRP المعقدة البيروكسيديز للتنافس على streptavidin مواقع الربط. مرة أخرى،ويتم رصد المستويات النسبية للالبيوتين تنتج الخلايا عن طريق قياس إشارة OD 450.
معا، والخلايا المهندسة والسطوح functionalized تتيح لنا التحكم في خصائص سطح برمجة عن طريق حفز الشبكات في الخلايا الحية. وبعبارة أخرى، لقد أنشأنا نظاما يستفيد من القدرة على التكيف للكائنات الحية وموثوقية ومواصفات واجهة المواد الهندسية من خلال ربط هذه الأنظمة معا.
Protocol
Representative Results
Discussion
لقد قدمنا استراتيجية جديدة للتفاعل الخلايا المهندسة الذين يعيشون مع سطح المواد functionalized. وقد تحقق ذلك من خلال تطوير خط الخلية قادرة على تجميع مستويات مرتفعة من البيوتين عندما الناجم مع IPTG. ومن ثم يمكن استخدام مستويات مرتفعة من البيوتين لتعديل سطح functionalized. فصلت الب…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
والكتاب الامتنان بدعم من جائزة FA9550-13-1-0108 من مكتب سلاح الجو للبحوث العلمية في الولايات المتحدة الأمريكية. الكتاب يقر بالإضافة إلى ذلك بدعم من جائزة N00014-15-1-2502 من مكتب البحوث البحرية للولايات المتحدة الأمريكية، وتمويل من معهد للتكنولوجيا الحرجة والعلوم التطبيقية في معهد البوليتكنيك فرجينيا وجامعة ولاية، ومن مؤسسة العلوم والبحوث الوطنية العليا برنامج الزمالة، جائزة رقم 1607310.
Materials
| LB Broth, Miller | Fisher Scientific | 12-795-027 | |
| Agar | Fisher Scientific | BP9744500 | |
| Carbenicillin | Fisher Scientific | BP26481 | |
| M9, Minimimal Salts, 5X | Sigma-Aldrich | M6030 | |
| Casamino Acids | Fisher Scientific | BP1424-100 | |
| Magnesium Sulfate, Anhydrous | Fisher Scientific | M65-500 | |
| Calcium Chloride, Dihydrate | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Dextrose (D-Glucose), Anhydrous | Fisher Scientific | D16-1 | |
| NEB Turbo Cell Line | New England Biolabs | C2984l | |
| Oligonucleotide Primers | Thermo Fisher Scientific | N/A | 25N synthesis, DSL purification |
| Q5 High-Fidelity Polymerase | New England Biolabs | M0491S | |
| Q5 Reaction Buffer | New England Biolabs | B9027S | |
| dNTP Solution Mix | New England Biolabs | N0447S | |
| Agarose | Bioexpress | E-3120-125 | |
| Ethidium Bromide, 1% | Fisher Scientific | BP1302-10 | |
| Gel Extraction Kits | Epoch Biolabs | 2260250 | |
| GenCatch Plasmid DNA Miniprep Kit | Epoch Biolabs | 2160250 | |
| AatII | New England Biolabs | R0117S | |
| SacII | New England Biolabs | R0157S | |
| HindIII-HF | New England Biolabs | R3104S | |
| EcoRI-HF | New England Biolabs | R3101S | |
| Cutsmart Buffer | New England Biolabs | B7204S | |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| T4 DNA Ligase Reaction Buffer | New England Biolabs | B0202S | |
| ColiRolle Glass Plating Beads | EMD Millipore | 7101-3 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Fisher Scientific | BP1755-10 | |
| NHS-Desthiobiotin (DTB) | Thermo Fisher Scientific | 16129 | |
| Succinimidyl Trans-4-(maleimidylmethyl) Cyclohexane-1-Carboxylate (SMCC) | Thermo Fisher Scientific | S1534 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | BP231-100 | |
| Succinimidyl 3-(2-pyridyldithio) Propionate (SPDP) | Thermo Fisher Scientific | S1531 | |
| NHS-LC-LC-biotin | Thermo Fisher Scientific | 21343 | |
| Horseradish Peroxidase (HRP) | Thermo Fisher Scientific | 31490 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), 10X Solution | Fisher Scientific | BP399500 | |
| Streptavidin (SA) | Thermo Fisher Scientific | 21145 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Fisher Scientific | BP172-5 | |
| Ethylenediaminetetaacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | S311-500 | |
| Tween 80 | Fisher Scientific | T164-500 | |
| Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | H325-4 | |
| 3, 3', 5, 5'-tetramethylbenzidine (TMB) | Fisher Scientific | AC229280050 | |
| Vivaspin 500 Centrifugal Concentrators | Viva Products | VS0192 | |
| Sodium Acetate, Anhydrous | Fisher Scientific | BP333-500 | |
| 96-Well Polystyrene Plates | Thermo Fisher Scientific | 266120 |
References
- Zhang, R., Heyde, K. C., Scott, F. Y., Paek, S. -. H., Ruder, W. C. Programming Surface Chemistry with Engineered Cells. ACS Synth. Biol. , (2016).
- Zhou, X., et al. Reduced graphene oxide films used as matrix of MALDI-TOF-MS for detection of octachlorodibenzo-p-dioxin. Chem. Commun. 46, 6974-6976 (2010).
- Pardee, K., et al. Low-Cost Detection of Zika Virus Using Programmable Biomolecular Components. Cell. 165, 1255-1266 (2016).
- Bähring, S., et al. Design and Sensing Properties of a Self-Assembled Supramolecular Oligomer. Chem. Eur. J. 22, 1958-1967 (2016).
- Nicolau Jr, D. V., Armitage, J. P., Maini, P. K. Directional persistence and the optimality of run-and-tumble chemotaxis. Comp. Biol. Chem. 33, 269-274 (2009).
- Du, J., Shao, Z., Zhao, H. Engineering microbial factories for synthesis of value-added products. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 38, 873-890 (2011).
- Kim, H., Kim, M. J. Electric Field Control of Bacteria-Powered Microrobots Using a Static Obstacle Avoidance Algorithm. IEEE Trans. Rob. 32, 125-137 (2016).
- Gardner, T. S., Cantor, C. R., Collins, J. J. Construction of a genetic toggle switch in Escherichia coli. Nature. 403, 339-342 (2000).
- Heyde, K. C., Ruder, W. C. Exploring Host-Microbiome Interactions using an in Silico Model of Biomimetic Robots and Engineered Living Cells. Sci. Rep. 5, 11988 (2015).
- Rice, M. K., Ruder, W. C. Creating biological nanomaterials using synthetic biology. Sci. Tech. Adv. Mater. 15, 014401 (2014).
- Green, N. M. Avidin. 3. The nature of the biotin-binding site. Biochem. J. 89, 599-609 (1963).
- Mesulam, M. M. Tetramethyl benzidine for horseradish peroxidase neurohistochemistry: a non-carcinogenic blue reaction product with superior sensitivity for visualizing neural afferents and efferents. J Histochem. Cytochem. 26, 106-117 (1978).
- Litcofsky, K. D., Afeyan, R. B., Krom, R. J., Khalil, A. S., Collins, J. J. Iterative plug-and-play methodology for constructing and modifying synthetic gene networks. Nat. Meth. 9, 1077-1080 (2012).
- Gibson, D. G., et al. Complete Chemical Synthesis, Assembly, and Cloning of a Mycoplasma genitalium Genome. Science. 319, 1215-1220 (2008).
- Diamandis, E. P., Christopoulos, T. K. The biotin-(strept)avidin system: principles and applications in biotechnology. Clin. Chem. 37, 625-636 (1991).
- Nerurkar, L. S., Namba, M., Brashears, G., Jacob, A. J., Lee, Y. J., Sever, J., L, Rapid detection of herpes simplex virus in clinical specimens by use of capture biotin-streptavidin enzyme-linked immunosorbent assay. J. Clin. Micro. 20, 109-114 (1984).
- Cui, Y., Wei, Q., Park, H., Lieber, C. M. Nanowire Nanosensors for Highly Sensitive and Selective Detection of Biological and Chemical Species. Science. 293, 1289-1292 (2001).
