利用合成生物学工程师活细胞接口，具有可编程材料
Summary
本文提出了一系列的开发改造的细胞和，使综合工程大肠杆菌控制和操纵可编程材料的表面功能化表面的协议。
Abstract
我们已开发出一种非生物-生物界面，允许工程细胞以控制官能化表面的材料性质。 大肠杆菌细胞的合成工程化菌株和官能化材料的界面：该系统是通过创建两个模块制成。在本文中，我们详细介绍了基因工程利用分子克隆策略大肠杆菌菌株内选择行为的协议。一旦开发，当暴露于化学诱导该菌株产生的生物素的水平升高。此外，我们创建两个不同的官能化的表面，其中每一个能够以细胞合成的生物素响应详细协议。综上所述，我们提出了一个方法来创建一个允许工程细胞，以控制非生物基材料成分和组装链接，非生物，生物系统。
Introduction
这里，我们报告开发能够从工程改造的细胞系响应于化学信号的可编程衬底的步骤。 1，我们通过创建生物素-链霉接口，响应生物素由合成工程化的大肠杆菌（大肠杆菌）细胞中产生的做到这一点。此前，可编程的表面经过特别设计，从毒素检测2点护理诊断3到国防和安全的广泛应用。 4虽然可编程表面可以是传感器和致动器是有用的，它们可以通过与以适应不同的环境挑战的能力赋予他们进行“更聪明”。相比之下，即使是简单的微生物，如大肠杆菌 ，具有内在的适应性，并能够应对成熟而往往出人意料解决方案的挑战。这种适应性使E.大肠杆菌群，通过其复杂的基因网络控制，经济有效地寻求资源，创建5产品附加值，6，甚至电源微观尺度的机器人。 7通过结合活细胞与使用可编程表面中的自适应优点，我们可以创建能够响应不同环境条件的一个聪明衬底。
合成生物学给了研究人员的新能力，生物体的行为进行编程。通过工程细胞包含新的基因调控网络，研究人员可以设计出多种编程行为细胞。 8，9之外的基础研究中，可使用的应用，如控制材料组件和生物学生产增值产品这些行为。 10在此，我们我们详细介绍如何利用合成生物学的工具来恩gineer 大肠杆菌菌株在诱导合成生物素。该菌株是通过使用限制性内切酶克隆的方法来组装一个质粒，pKE1-的lacI-bioB开发的。该质粒中，当转化到大肠杆菌 K-12菌株MG1655，赋予细胞以表达bioB，生物素合成的必需酶水平升高的能力。当转化的细胞用异丙β-D-1-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导，并设置有生物素的前体，脱硫生物素（DTB），制作了生物素的水平升高。
生物素与链霉结合相互作用是在自然界中发现的最强的非共价键中的一个。这样，生物素 – 链霉相互作用既充分表征和生物技术高度使用。 11在这个手稿中，我们提出采用生物素-链霉亲和的互动感知和检测细胞生产生物素具有功能化表面两种策略。我们参照这些对立表面，“间接”和“直接”控制方案。在间接控制方案中，细胞产生的生物素与已经缀合和固定在聚苯乙烯表面为链霉结合位点的生物素竞争。此外，链霉抗缀合有辣根过氧化物酶（HRP）。 HRP修饰3，3'，5，5'-四甲基联苯胺（TMB），以产生光信号，12可以由在450nm（OD 450）定量分光吸收（ 即光密度）进行监测。因此，间接控制方案允许研究人员通过监测OD 450信号的attentuation测定细胞生产生物素。
直接控制方案利用直接固定到链霉亲和材料表面并允许细胞产生的生物素和生物素化HRP链霉结合位点的竞争链霉亲和素事件。再次，在细胞产生的生物素的相对水平是通过测量的OD 450信号监测。
两者合计，改造的细胞和官能化表面允许我们通过在活细胞中诱导的网络控制可编程表面的属性。换言之，我们已经创建了一个系统，该系统通过这些系统连接起来需要生物体的适应性和可靠性和说明书中的工程材料界面的优点。
Protocol
Representative Results
Discussion
我们已经提出用于连接工程活细胞与官能材料表面的新策略。这通过开发能够当用IPTG诱导合成生物素的水平升高的细胞系实现的。生物素的水平升高然后可用于修改功能化表面。该协议详细讲述了工程师大肠杆菌细胞系，以及如何创建两个不同的官能表面。
在这个协议中的关键步骤发生在整个工程细胞株的构建。以避免下游的问题，表征与两个生长曲线的工程细胞株?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者非常感谢来自美国的科学研究空军办公室从获奖FA9550-13-1-0108支持。作者还从美国的海军研究办公室确认来自奖N00014-15-1-2502支持，从研究所的关键技术和应用科学在弗吉尼亚理工学院和州立大学和美国国家科学基金会研究生科研经费奖学金计划，奖号1607310。
Materials
| LB Broth, Miller | Fisher Scientific | 12-795-027 | |
| Agar | Fisher Scientific | BP9744500 | |
| Carbenicillin | Fisher Scientific | BP26481 | |
| M9, Minimimal Salts, 5X | Sigma-Aldrich | M6030 | |
| Casamino Acids | Fisher Scientific | BP1424-100 | |
| Magnesium Sulfate, Anhydrous | Fisher Scientific | M65-500 | |
| Calcium Chloride, Dihydrate | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Dextrose (D-Glucose), Anhydrous | Fisher Scientific | D16-1 | |
| NEB Turbo Cell Line | New England Biolabs | C2984l | |
| Oligonucleotide Primers | Thermo Fisher Scientific | N/A | 25N synthesis, DSL purification |
| Q5 High-Fidelity Polymerase | New England Biolabs | M0491S | |
| Q5 Reaction Buffer | New England Biolabs | B9027S | |
| dNTP Solution Mix | New England Biolabs | N0447S | |
| Agarose | Bioexpress | E-3120-125 | |
| Ethidium Bromide, 1% | Fisher Scientific | BP1302-10 | |
| Gel Extraction Kits | Epoch Biolabs | 2260250 | |
| GenCatch Plasmid DNA Miniprep Kit | Epoch Biolabs | 2160250 | |
| AatII | New England Biolabs | R0117S | |
| SacII | New England Biolabs | R0157S | |
| HindIII-HF | New England Biolabs | R3104S | |
| EcoRI-HF | New England Biolabs | R3101S | |
| Cutsmart Buffer | New England Biolabs | B7204S | |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| T4 DNA Ligase Reaction Buffer | New England Biolabs | B0202S | |
| ColiRolle Glass Plating Beads | EMD Millipore | 7101-3 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Fisher Scientific | BP1755-10 | |
| NHS-Desthiobiotin (DTB) | Thermo Fisher Scientific | 16129 | |
| Succinimidyl Trans-4-(maleimidylmethyl) Cyclohexane-1-Carboxylate (SMCC) | Thermo Fisher Scientific | S1534 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | BP231-100 | |
| Succinimidyl 3-(2-pyridyldithio) Propionate (SPDP) | Thermo Fisher Scientific | S1531 | |
| NHS-LC-LC-biotin | Thermo Fisher Scientific | 21343 | |
| Horseradish Peroxidase (HRP) | Thermo Fisher Scientific | 31490 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), 10X Solution | Fisher Scientific | BP399500 | |
| Streptavidin (SA) | Thermo Fisher Scientific | 21145 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Fisher Scientific | BP172-5 | |
| Ethylenediaminetetaacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | S311-500 | |
| Tween 80 | Fisher Scientific | T164-500 | |
| Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | H325-4 | |
| 3, 3', 5, 5'-tetramethylbenzidine (TMB) | Fisher Scientific | AC229280050 | |
| Vivaspin 500 Centrifugal Concentrators | Viva Products | VS0192 | |
| Sodium Acetate, Anhydrous | Fisher Scientific | BP333-500 | |
| 96-Well Polystyrene Plates | Thermo Fisher Scientific | 266120 |
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